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        Sephacryl S-1000 层析法去除质粒 DNA 制备物中的小片段核酸

        相关实验:Sephacryl S-1000 层析法去除质粒 DNA 制备物中的小片段核酸

        最新修订时间:

        原理

        Sephacryl S-1000 层析是一个可供选择的将质粒 DNA 与小分子核酸(DNA 和 RNA ) 分离的方法。这一方法由波士顿麻省总医院的 F.DeNoto 和 H.Goodman 首先采用,后来由 Gomez-Marquez 等总结成论文发表于 1987 年。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶剂

        溴酚蓝蔗糖溶液,乙醇,酚,Sephacryl 平衡缓冲液,乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2),含有浓度为 20 μg/ml RNase A 的 TE(pH 8.0)。

        2. 凝胶

        0.7% 琼脂糖,用 TBE 配制。

        3. 核酸和寡核苷酸

        DNA 样品,CsCl 密度梯度离心纯化。

        4. 离心机和转子

        Sorvall SS-34 转子或性能相同的其他转子

        5. 专用设备

        填装 Sephacryl 树脂的层析柱,Sephacryl S-1000 凝胶过滤树脂(Pharmacia)

        二、方法

        1. 准备一个 1x10 cm 的 Sephacryl S-1000 层析柱,用 Sephacryl 平衡缓冲液平衡。

        2. 测定质粒制备物体积。加入 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2 ) 和 2 倍体积的乙醇,混匀,于 4℃ 放置 30 min。

        3. 于 4℃ 以大于 10000 g(相当于用 Sorvall ss-34 转头 9100 r/min)离心 15 min 回收核酸,尽可能去掉上清,打开管口,在工作台上放置几分钟,使最后残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

        4. 用含有 RNA 酶Ⅰ的少量 TE ( pH 8.0 ) ( 至多 400 μl)重新溶解潮湿的质粒 DNA 沉淀,RNA 酶的终浓度至少为 100 μg/ml。

        5. 质粒 DNA 溶液于室温下温育 1 h。

        6. 用等体积的 TE ( pH 8.0 ) 平衡的苯酚抽提一次。

        7. 吸取上层水相溶液,加 100 μl 溴酚蓝蔗糖溶液。将蓝色的一层溶液铺在 Sephacryl S-1000 层析柱上。

        8. 将质粒 DNA 溶液装入层析柱,并用 Sephacryl 平衡缓冲液洗柱,立即开始 0.5 ml 组分的分部收集。

        9. 当收集 15 个组分之后,用夹子夹住层析柱的底部,此时,蓝色的染料应刚好流经层析柱的一半。

        10. 从各收集的组分中各取 10 μl 样品,用 0.7% 的琼脂糖电泳及溴化乙锭荧光染色来确定含有质粒 DNA 的组分。

        11. 将含有质粒 DNA 的组分合并在一起,加 2 倍体积的乙醇,于 4℃ 沉淀 10 min。然后于 4℃ 以大于 10000 g 离心 15 min(相当于用 Sorvall SS-34 转头 9200 r/min)回收 DNA 沉淀。

        12. 尽可能去掉上清,打开管口,在工作台上放置几分钟,使最后残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

        13. 用 TE ( pH 8.0 ) 溶解潮湿的质粒 DNA 沉淀。

        来源:丁香实验

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