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        蛋白质的定量测定实验

        相关实验:蛋白质的定量测定实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        牛血清白蛋白 (BSA) 标准溶液 (2 mg/ml 水溶液)

        Bradford 试剂(CoomassiePlus,PierceChemicalCo.)

        分光光度计 (可在 595nm 处测量的) 或酶联仪 (带 595-nm 滤光片的)

        微量滴定板(ImmulonTM2,Dynatech Laboratories,Inc.)

        试剂

        Tris-缓冲盐溶液(TBS)

        (配方,见"试剂的配制" PP.184~189)

        操作程序

        1) 用 TBS 配制成一系列稀释度的 BSA 标准溶液,BSA 含量分別为:2000、1000、500、250、125、62.5 和 31.25ug/ml。每个待测的未知样品亦用 TBS 配制成一组倍比稀释的样品液。

        2) 各取 5ul BSA 稀释液和未知样品稀释液,分别加入 1 ml Bradford 试剂。混合后,室温孵育 5 min, 并在 1 h 内测 A595nm 值。如有酶联仪可用,测 A595nm 值则更为方便。用微量滴定板法时,各样品取 7ul 加入 200ul Bradford 试剂中,用加样器吸头混合,并保证微孔中无气泡存在。若有气泡,则可用一 22 号针头将气泡刺破。室温下孵育 5 min 后,测定 A595nm 值。

        3) 可测两种对照。—是测定存在于样品中的各种缓冲液,看看它们本身是否会显色。二是在有不同缓冲液存在的条件下测定中间浓度范围的 BSA 标准,看看这些缓冲液是否干扰 BSA 的显色。

        4) 作标准曲线,确定未知样品的蛋白浓度。
        注:由于σ32 纯化过程中所甩的-些试剂(如:SKL、脱氧胆酸钠和聚乙烯亚胺对本法有一定干扰,为此,我们找到了一种可以仿效的微量方法,即用 0、5、10、15 和 25ug/ml BSA 及 100、200 和 400 倍稀释的制备物样品进行测定。在微量滴定板各孔中,先加 100ul Bradfod 试剂,再分别加入各稀释样品 100ul, 然后按上述步骤搡作。

        来源:丁香实验

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