PEI 沉淀法分级分离可溶性提取物实验

材料与设备

提取液〔0.2% 脱氧胆酸钠 (DOC) 上清，见实验 1，P.146~147〕

Tissuc-Tearor^TM 匀浆器（Fisher Scientific 15-338-55)

硫酸铵 (AMS)

试剂

聚乙烯亚胺 (PEI)(10% 储液,pH7.9)

缓冲液 A

缓冲液 A+0.3mol/LNaCl

缓冲液 A+0,9mol/LNaCl

二硫苏糖醇 (DTT)(0.1moVL)

(配方，见“试剤的配制” PP.I84~189)

操作程序

1) 将 0.75 ml10%PEI 液加入体积约为 24 ml 的可溶性提取物 (0.2%DOC 上清) 中, 使 PEI 终浓度为 0.3%。混合后，4°C 下静置 15 min。

方案补充实验：加 PEI 前，取 6x50ul 的 0.2%DC 上清，用以确定沉淀σ32 和 RNA 聚合酶所需的 PEI 量（见 p.174)。加入 PEI 后，再取 6X50ul 的 PEI 悬液，用以确定从 PEI 沉淀物洗脱σ32 和 RNA 聚合酶所箱的盐量 (见 P.175)。

2) 悬液于 4°C、5000r/min 离心 10 min。上清弃去前留样（样品 E)。保留沉淀物。

3) 对 PEI 沉淀物，加 20 ml 缓冲液 A+0.3mol/L NaCl, 在低盐浓度下洗涤沉淀物。用 Tissue-Tearor 匀浆器剧烈重悬沉淀物后，于 4°C 下至少静置 10 min。

4) 悬液于 5000r/min 离心 10 min。上清弃去前留样（样品 F)。保留沉淀物。

注：低盐洗涤可从 PEI 沉淀物中洗掉某些蛋白质，而留下游离的和复合于核心 RNA 聚合酶的σ³²。这一步大致等同于从 DEAE-Sepharose 柱的低分辨率的盐洗脱。

5) 对 PEI 沉淀物，加 20 ml 缓冲液 A+0.9mol/L NaCl，进行高盐洗脱。用 Tissue Tearor 匀浆器剧烈重悬沉淀物后，于 4°C 下至少静置 10 min。

6) 悬液于 4°C、13000r/min 离心 10 min。倾出并保留上清（是为高盐洗脱物)。取样（样品 G)。
注：高盐洗脱，释出复合于核心 RNA 聚合海的σ³², 而其他物质（大部分为核酸）则留于沉淀。沉淀会相当多。

7）为除去髙盐洗脱物中的 PEI, 每 20 ml 慢慢加入 7.6 g AMS, 得 55% 饱和 AMS 溶液。不断搅拌混合，直至所有的 AMS 全部溶解。于冰上静置过夜（或至少 30 min)。再加 20ul 0.1mol/L DTT, 使 DTT 终浓度为 0.1 mmol/L。

8)4°C、13000r/min 离心 10 min。上清弃去前留样（样品 H)。沉淀物于冰箱保存过夜。
注：AMS 是通过增强疏水作用而使蛋白质沉淀的。55% 饱和 AMS 帑液可沉淀出大部分蛋白质，而将 PEI 和少量蛋白质留于上清。达到沉淀所需的 AMS 量随蛋白质及其浓度而异。