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        用检测和驱动 DNA 探针进行差异杂交实验

        相关实验:用检测和驱动 DNA 探针进行差异杂交实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        高严格性洗涤缓冲液(0.2XSSC,5 g/LSDS),预热到 68°C(可选,见第 9 步)

        低严格性洗涤缓冲液(2XSSC,5 g/LSDS),预热到 68°C(可选,见第 9 步)

        SDS,5 g/L(可选,见第 9 步)

        SSC,20X(1L 配方:175.3 gNaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠,pH7.0)

        2. 核酸和寡核苷酸

        Blocking 溶液 [含有 2 mg/ml 未纯化的 NP1、NP2R、cDNA 合成引物(使用 cDNA 的情况下),以及它们的互补寡核苷酸]

        经过剪切的鲑鱼精 DNA(10 mg/ml)

        3. 探针

        纯化的检测者和驱动者探针,随机引物法标记(每 100ng 消减 DNA 至少 107cpm)(可选,见第 9 步)

        4. 专用设备

        沸水浴

        杂交炉,预热至 72°C

        5. 附加试剂

        ExpressHyb Hybridization Kit(Clontech)

        放射自显影所需的试剂与设备

        二、方法

        1. 使用商业试剂盒,用随机引物法标记驱动和检测 DNA 探针。这里所给的杂交条件是根据 Cbntech 的 ExpressHyb 溶液来优化的;对于其他系统,应该根据经验来确定最佳杂交条件。

        2. 为每张膜配制足够体积的预杂交溶液。

        a. 混合下列溶液:5ul 20XSSC,5ul 经过剪切的鲑鱼精 DNA(10 mg/ml) 和10ul 阻断溶液 [含有 2 mg/ml 未纯化的 NP1、NP2R、cDNA 合成引物(使用 cDNA 的情况下),以及它们的互补寡核苷酸]。

        b. 将阻断溶液煮沸 5 min, 然后在冰上冷却。

        c. 将阻断溶液与 5 ml ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech) 混合。

        3. 将每张旗放到第 2 步配制的预杂交液中,72°C 振荡条件下预杂交 40~60 min。

        在预杂交液中加入阻断溶液是很重要的,因为消减探针与所分析的克隆具有相同的接头序列,不管其内部序列如何, 这些探针都能同所有克隆杂交。

        4. 制备杂交探针。

        a. 混合下列溶液:50ul 20XSSC,50ul 经过剪切的鲑鱼精 DNA(10 mg/ml),10ul 阻断溶液,以及纯化的探针(每 100ng 消减 DNA 至少 107cpm)。确保每种探针的特异活性都大致相等。

        b. 将探针煮沸 5 min,然后在冰上冷却。

        c. 将探针加到预杂交液中。

        5.72°C 振荡杂交过夜。

        6. 配制低严格性(2XSSC,5 g/LSDS) 和高严格性(0.2XSSC,5 g/LSDS) 洗涤缓冲液,并加热到 68°C。

        7. 依次用低严格性缓冲液(4X20 min,68°C) 和高严格性缓冲液(2X20 min,68°C)洗膜。

        8. 进行放射性自显影。

        9. 如果需要,在 5 g/LSDS 中煮沸 7 min, 可以除去探针。

        印迹一般可以重复使用至少 5 次。

        为了将杂交背景降到最低,不使用时应将旗放在 SaranWrap 中,-20°C 保存。

        来源:丁香实验

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