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        激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增实验

        相关实验:激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        琼脂糖

        二甲基亚砜(见注释 1)(DMSO)

        溴化乙锭

        乙酸镁(见注释 2)[(CH3COO)2 Mg]25 mmol/L(AppliedBiosystems4339582/4339585)

        去除 RNA 酶的水

        SYBRGreen I Dye(见注释 1)(分子探针)

        2. 酶和酶缓冲液

        5XAccuRT 缓冲液(见注释 2)(Applied Biosystems 4339582/4339585)

        Gene Amp Accu RT RNA PCR 酶(见注释 2):3.75U/ul(Applied Biosystems 4339585)

        AmpErase 尿嘧啶-N-糖基酶(UNG):1U/ul(AppliedBiosystems)

        3. 核酸和寡核苷酸

        脱氧核苷三磷酸:中性10mmol/L 溶液(AppliedBiosystems,N808-0007/N808-0095含 20 mmol/LdUTP 以替代 dTTP)。

        寡核苷酸引物:15umol/L 溶于 10 mmol/LTris-HCl 溶液,pH8.3。

        RNA:通常保存于含载体 RNA 的溶液中,如 30ug/mlE.colirRNA 或 poly(rA),或保存于 10 mmol/LTris-HCl、pH7.0,lmmol/LEDTA,0.lmmol/LNaCl 中,两者都需去除 RNA 酶的水。

        4. 特殊设备

        琼脂糖凝胶的电泳设备

        GeneAmpPCR 系统 9700/2700(AppliedBiosystems) 或类似产品实时定量 PCR 检測系统(见注释 1): 例如 AppliedBiosystems 的 GeneAmp5700 测序系统或 ABIPRISM7000、7700/7900 HT 测序系统或 RocheAppliedScienceLightCycler

        5. 其他

        MicroAmp 反应管(AppliedBiosystems) 或类似产品

        激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增实验

        二、方法

        1.RNA 分离

        制备高质量的 RNA 极为重要,对此市场上有许多商业化产品以及详细的方法可用

        (DieffenbachandDveksler1995;Farrell1998;SambrookandRussell2001; 第 10 章)。

        2.RT 和 PCR 扩增的组合

        (1) 有 dTTP 而无 UNG 下进行的反应

        ①解冻所有试剂,轻微振荡,避免产生泡沫。

        ②在微型离心机中将酶和试剂甩至管底,置冰上。

        ③混合下列试剂(注意:黑体字项目在有 dUTP 和 UNG 时浓度是不同的)。

        激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增实验

        ④轻微振荡上述混合物,加 1.00ulRNA(至 1ug,见 16.1 疑难解答和技巧),轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除 RNA 酶的水和 RNA 的混合物,只要主要混合物和 RNA 的总体积等于 50ul。

        ⑤在 GeneAmpPCRSystem9700/2700 上按下列程序进行反应。

        65°C,保持 30 min(反转录)

        95°C,保持 lmin

        95°C,15s;65°C,30s, 进行 40 个循环(PCR 扩增)

        65°C, 保持 7 min

        ⑥反应物可直接用于分析或于-20°C 储存。

        (2) 使用 dUTP 和 UNG 进行反应(针对污染控制系统和 UNG 介导的热启动)

        ①解冻所有试剂,轻微振荡,避免产生泡沫。

        ②在微型离心机中将酶和试剂离心到管底,置冰上,

        ③混合下列试剂(注意:黑体字项目在进行有 dTTP 和无 UNG 反应时使用不同浓度)。

        激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增实验

        ④轻微振荡上述混合物,加 1.00ulRNA(至 1ul; 见 16.1 疑难解答和技巧),轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除 RNA 酶的水和 RNA 的混合物,只要主要混合物和 RNA 的总体积等于 50ul。

        ⑤在 GeneAmpPCRSystem9700/2700 上按下列程序进行反应。

        50°C, 保持 2 min(UNG 步骤)

        65°C,保持 30 min(反转录步骤)

        95°C,保持 lmin

        95°C,15s;65°C,30s, 进行 40 个循环(PCR 扩增)

        65°C,保持 7 min

        ⑥反应物可直接用于分析,为使 UNG 失活,可于-20°C:储存或进行化学处理(如用等体积的氯仿进行抽提),因 UNG 长期存在会破坏扩增产物。反应物可长期储存于-20°C:。UNG 在分析之前不需要进行失活,然而在室溫或者低于 55°C 时它能破坏反应中的复制子。

        3. 反应产物分析

        为检测扩增产物,可用含 0.5ug/ml 溴化乙锭(EB) 的 2% 琼脂糖进行电泳,也可用实时定量 PCR 的 TaqMan 技术(Mengetal.2001)。用 EB(HiguchiandWaston1999;KangandHolland1999;Kangetal.2000;Holland2002) 或 SYBRGreenI(Baranzinietal.2000) 染色,通过 EB 或 SYBRGreenI 结合反应产物双链 DNA 发出的荧光来检测。当使用 SYBRGreenI 时,浓度控制非常重要,20 倍母液存于 100%DMSO(20 倍母液指 500 倍 SYBRGreenI 存于 DMSO 溶液),使用的最终浓度为 0.2 倍,高于该浓度据证实会抑制 RT 反应的许多酶的活性。

        来源:丁香实验

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