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        RNA 放射性标记

        相关实验:RNA 放射性标记

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一材料与设备

        1)[α32P]UTP 或 CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。

        2)UTP 或 CTP。

        3)T4 多核苷酸激酶

        4)10XT4 多核苷酸激酶缓冲液

        5)(γ32P)ATP(3000Ci/mmol;10mCi/ml)

        6) 牛小肠磷酸酶

        7)DEPC 处理的水

        8)10X 磷酸酶缓冲液

        9)TE(pH7.4)

        10)5mol/LNaCl

        11)TE(pH7.6)

        12)T4RNA 连接酶

        13)[32P]pCp(3000Ci/mmol;lOmCi/ml)

        14)10XT4RNA 连接酶缓冲液

        15)DMSO

        16)ATP,20umol/L。

        17 无 tRNA 酶的牛血清白蛋白


        二、操作方法

        (一)RNA 内部标记

        1) 在体外转录体系中加入 5ul[α32P]UTP 或 CTP(800Ci/ml,10mci/ml),不加未标记的 UTP 或 CTP 或限制它们的浓度为 10〜15umol/L, 孵育时间最长为 1 h

        2)DNase 消化后,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 RNA, 纯化标记的全长 RNA。

        (二)5'端标记 RNA

        逋过 T4 多核苷酸激酶在 5'端标记 RNA。这个酶将 [32P] 由 [γ-32P]ATP 上转移到分子的 5'端. 伹 5'端标记的 RNA 分子需要先用牛小肠磷酸酶去除非同位素的 5'磷酸。

        1) 用 DEPC 处理的水稀释 1〜2ugRNA 至终体积为 16ul,95℃ 下放置 2 min 后,冰浴5 min, 变性 RNA

        2) 加入 2ul10X 磷酸酶反应缓冲液,2ul 牛小肠磷酸酶 (1U/ul);37℃ 反应 30 min

        3) 用 TE(pH7.4) 稀释 RNA 至终体积为 200ul, 加 6ul5mol/LNaCl 如前所述沉淀RNA。

        4) 用 TE(pH7.6) 重悬 RNA 至 RNA 浓度为 0.5ug/ul。取 2ulRNA 溶液,95℃ 放置 2 min 后,冰浴 5 min

        5) 加 10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 4ul[γ32P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4 多核苷酸激酶 (3〜6U/ul),于 37°C 孵育 30 min

        6) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的 RNA

        (三)3'端标记 RNA

        利用 T4RNA 连接酶和过量的 [32P]p4 以标记 RNA 的 3'端

        1) 将 1〜2ugRNA 于 68℃ 放置 2 min 后,冰浴 5 min, 使之变性

        2) 加入 4ul10XT4RNA 连接酶缓冲液,4ul DMSO,1ul20umol/LATP,1ul l0ug/ml 无 RNA 酶的牛血清白蛋白,1〜2ug RNA,5〜10ul[32P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml),用 DEPC 处理水补足总体积 40ul。4°C 孵育过夜。

        3) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的 RNA。

        来源:丁香实验

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