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        一种简单有效的降低 RNA 3'端异质性的转录方法

        相关实验:一种简单有效的降低 RNA 3' 端异质性的转录方法

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一材料与设备

        1)8umol/L 顶链

        2)8umol/L 底链,5'末端 2 个核苻酸进行甲氧基修饰

        3)20X 缓冲液:800 mmol/LNaCl.20 mmol/L 精胺,100 mmol/LDTT,0.2%TritonX-100(pH8.l)

        4)NTP 混合物,各 80mol/L, 用 1mol/LNaOH 调 PH8.1

        5)lmol/LNaOH。

        6) 聚乙二醇 8000,400 mg/ml。

        7)0.5mol/LMgCl2

        8)1mol/L 谷氨酸钠 (pH8.l)

        9)T7 RNA 聚合酶。

        10) 载样缓冲液:8mol/L 尿素,lmmol/LEDTA,0,1% 一甲苯青 FF,0.1% 溴酚蓝


        二、操作方法

        1) 在灭菌微量离心管中混合下列物质:

        8umol/L 顶链 (终浓度 400nmol/L)                             1ul

        8umol/L 底链(5'端 2 个核苷                                 1ul

        酸甲氧基修饰,终浓度 400nmol/L)

        20X 缓冲液                                                              2ul

        NTP 混合物                                                            2ul

        聚乙二醇 8000                                                        5ul

        0.5mol/LMgCl                                                   1.12ul

        1mol/L 谷氨酸钠                                                     1ul

        T7RNA 聚合酶                                                        1ul

        加无核酸酶的水至总体积为                                    20ul

        2) 于 37℃ 反应 lh。

        3) 加载样液,变件聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收,保存于一 20℃

        注意事项

        1) 标准体系是 20ul 但每种成分可按比例放大体系,以增加转录物的量

        2) 一般来说,NTP 的摩尔数与 Mg2+的庠尔数比例为 1:1.75, 但此比例可能需要优化。

        3)对于某些模板,谷氨酸钠可以提尚转录产物的回收率。

        来源:丁香实验

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