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        从革兰氏阴性菌中快速分离RNA

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一 材料与设备

        1)10 ml 革兰氏阴性菌培养液,

        2) 原生质体缓冲液:15 mmol/LTris-Cl(pH8.0),0.45mol/L 蔗糖,8mmol/LEDTA.

        3)50 mg/ml 溶菌酶。

        4) 革兰氏阴性菌裂解缓冲液:10mmol/LTris-Cl(pH8.0),10 mmol/LNaCl,lmmol/L 柠檬酸钠,1.5%(m/V)SDS

        5) 饱和 NaCl 溶液,

        6)DEPC 处理水

        7) 乙醇

        二 操作方法

        1) 于 4℃ 12000g 离心从而从 10 ml 革兰氏阴性菌培养液中回收菌体,重悬于 10 ml 原生质体缓冲液,加入 50 mg/ml 溶菌酶,冰浴 15 min

        2) 室温或 4℃ 离心回收原生质体。重悬于 0.5 ml 革兰氏阴性菌裂解缓冲液,加入 DEPC 水,混匀。移至微量离心管中,37°C 温育 5 min,在冰浴巾冷却。

        3) 加入 250ul 饱和 NaCl,混匀,冰浴 10mim。

        4) 于用微量离心机高速离心 15 min, 将上清移至两个干净微量离心管中,各加入lml 无水乙醇,在干冰中沉淀 30 min 或-20°C 过夜

        5) 于 4℃ 用微量离心机高速离心 l5 min,用 500ul 冰冷 70% 乙醇冲洗沉淀,晾干。用 100ulDEPC 处理水溶解,取 10ul 稀释于 lml 水中,测 A260 和 A280 以定量 RNA. 保存于-70℃

        来源:丁香实验

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