原理
用机械法从细胞单层分离细胞，在 27°C 条件下和悬浮状态下进行扩增培养。
材料与仪器
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 |
步骤
常规维持培养
1. 通过刮取法或用培养液冲洗细胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或从甘蓝环 Trichoplusia ni 获得的细胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也称 “High Five ”，可从 Invitrogen 购买））法使细胞从培养瓶中脱落，或者利用在旋转瓶中悬浮生长的细胞。
2. 用血细胞计数板计数细胞，通过用台盼蓝或萘黑染色检査细胞的活力。
3. 以 0.5~1×106 个/ml 活细胞密度将细胞种植于旋转培养瓶内，每 500 ml 旋转瓶内注入 20~100 ml 细胞悬液。
4. 在 20~28°C 条件下培养细胞，以 37°C 为佳。
5. 每 48~72 h 或当细胞密度为 4~5×106 个/ml 时，将细胞稀释至 0.5~1×106 个/ml。
6. 每 3~4 周将细胞移入洁净的培养瓶。
7. 如果细胞群聚集，稍微加快搅拌速度，并加入表面活性剂 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。
冻存细胞（另见方案 20. 1)
1. 计数细胞，离心（1000 rpm ，约 200 g，5 min )。
2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混悬细胞，密度为 1×107 个/ml。
3. 将细胞分装入冻存管，然后将冻存管放在冰上 1 h。
4. 将冻存管装入苯乙烯泡沫容器。
5. 在 -70°C 条件下将冻存管缓慢冷冻过夜（约 1°C /min )。
6. 将冻存管移入液氮冻存器中。
7. 使冻存的细胞复苏时，将冻存管在 37°C 迅速融化。如果细胞以液相储存，在融化加盖容器中的细胞时应注意避免因冻存管破裂而导致受伤的危险。
8. 将细胞移入含 5 ml 培养液的 25 cm2 培养瓶。轻拍培养瓶，以便均匀地分散细胞。
9. 2~3 h 后吸去培养液。当大多数细胞贴壁时，加入 5 ml 新鲜培养液。
10. 在分离前将细胞培养 2~3 天，使细胞恢复。然后按前述方法，将细胞移入搅拌培养瓶或更大的塑料瓶。
1. 通过刮取法或用培养液冲洗细胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或从甘蓝环 Trichoplusia ni 获得的细胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也称 “High Five ”，可从 Invitrogen 购买））法使细胞从培养瓶中脱落，或者利用在旋转瓶中悬浮生长的细胞。
2. 用血细胞计数板计数细胞，通过用台盼蓝或萘黑染色检査细胞的活力。
3. 以 0.5~1×106 个/ml 活细胞密度将细胞种植于旋转培养瓶内，每 500 ml 旋转瓶内注入 20~100 ml 细胞悬液。
4. 在 20~28°C 条件下培养细胞，以 37°C 为佳。
5. 每 48~72 h 或当细胞密度为 4~5×106 个/ml 时，将细胞稀释至 0.5~1×106 个/ml。
6. 每 3~4 周将细胞移入洁净的培养瓶。
7. 如果细胞群聚集，稍微加快搅拌速度，并加入表面活性剂 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。
冻存细胞（另见方案 20. 1)
1. 计数细胞，离心（1000 rpm ，约 200 g，5 min )。
2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混悬细胞，密度为 1×107 个/ml。
3. 将细胞分装入冻存管，然后将冻存管放在冰上 1 h。
4. 将冻存管装入苯乙烯泡沫容器。
5. 在 -70°C 条件下将冻存管缓慢冷冻过夜（约 1°C /min )。
6. 将冻存管移入液氮冻存器中。
7. 使冻存的细胞复苏时，将冻存管在 37°C 迅速融化。如果细胞以液相储存，在融化加盖容器中的细胞时应注意避免因冻存管破裂而导致受伤的危险。
8. 将细胞移入含 5 ml 培养液的 25 cm2 培养瓶。轻拍培养瓶，以便均匀地分散细胞。
9. 2~3 h 后吸去培养液。当大多数细胞贴壁时，加入 5 ml 新鲜培养液。
10. 在分离前将细胞培养 2~3 天，使细胞恢复。然后按前述方法，将细胞移入搅拌培养瓶或更大的塑料瓶。
来源：丁香实验
