方案27.2 放射自显影术

建立培养

1. 在盖玻片、载玻片（Ninc，Bellco ) 或皮氏培养皿上建立几份同样的单层培养。

2. 在 37°C 条件下培养，直至细胞到达适合标记时。

加入核素

3. 通常以 0.1~10 μCi/ml (约 4.0 KBq~0.4 MBq/ml )、100 Ci/mmol ( 约 4 GBq/pmol ) 的量加入核素，适合处理 0.5~48 h。

4. 吸去全部含有核素的培养液，用 BSS 小心地清洗细胞，然后弃去培养液和洗液。

固定和处理细胞

5. 用冰冷的乙酸甲醇间定细胞 10 min。

6. 制片：

(a)盖玻片：用 DPX 或 Permmmt 将盖玻片封在载玻片上，细胞面向上。

(b)悬浮生长或胰蛋白酶消化后的细胞悬液：将细胞离心到玻片上或采用滴液制片。

(c)为了确定合适的曝光时间，多准备几张对照玻片，以便后面使用。从现在起所准备的玻片统称为 “玻片” 。

7. 当标记 DNA 、RNA 或蛋白质时，用冰冷的 0.6 mol/L TCA 提取酸溶性的前体（10 min，3 次）。同时进行对照提取，如用脂性溶剂或酶消化。

8. 用明胶溶液浸泡玻片 2 min 。

9. 垂直引流玻片上的液体后，使其晾干（这些玻片可在 4°C 条件下干燥储存)。

建立放射自显影

10. 将玻片移入暗室。

11. 在暗红色安全灯下，在 46°C 水浴箱将乳胶融化。

12. 用 1 张干净的玻片轻轻地将乳胶混匀，注意不要产生气泡。

13. 浸泡玻片：

(a)将玻片在 46°C 乳胶中浸泡 5 s，确认细胞被完全浸没。注意温度是至关重要的，将决定乳胶的厚度，并随之决定分辨率。

(b)取出玻片，引流乳胶 5 s。

(c)再将玻片用乳胶浸泡 5 s。

(d)取出玻片，垂直引流 5 s。

(e)用纸巾将每张玻片的背面揩干。

(f)将玻片平放在 1 张薄纸或滤纸片上 10 min，晾干。

(g)将玻片放在避光盒的格珊上，使其完全干燥。不要急于使玻片干燥，应在湿润的条件下慢慢晾干，以避免使乳胶脆弱。

14. 玻片干燥约 2~3 h 后，将其移入含有干燥剂如硅凝胶的避光显微切片盒中。保证不要触到玻片，并保证不要使玻片彼此接触或与干燥剂接触。

15. 用黑色乙烯胶带将切片盒密封，再用黑纸或聚乙烯包裹，然后将切片盒放入冷藏箱。确认这个冷藏箱不用于储存核素。

16. 将切片盒在 4°C 条件下放置 1~2 周。所需要的确切时间取决于样本的活性，这可通过间隔处理几张玻片来确定。玻片曝光时间过长时，背景加深和潜在的图像易于褪色。最好是增加标记活性而不使玻片曝光时间太长。

处理放射自显影细胞

17. 将切片盒带回暗室，在暗红色安全灯下将密封带拆开。

18. 使玻片恢复大气温度和湿度约 2 min。

19. 准备 20°C 显影液（20% Phenisol （Ilford））。

20. 将玻片在显影剂中放置 2.5 min，间隔地轻轻晃动。

21. 用超纯水将玻片进行简短冲洗。

22. 将玻片移入定影液（30 % 硫代硫酸钠）中，定影 5 min。

23. 用去离子水浸洗后，将玻片放在硫代硫酸钠定影剂中，定影 1 min。

24. 用冷的流水冲洗玻片，或通过 5 次换水将玻片清洗，5 min 以上。

25. 待玻片干燥后，用显微镜进行观察。也可用相差显微镜观察置入水中的 # 00 薄盖玻片。当观察完成时和在水干涸之前，将盖玻片取出，否则盖片将黏到乳胶上。

染色

26. 用苏木精染色：

(a)在刚过滤的苏木精中将玻片染 45 s。

(b)将玻片在流水中清洗 2 min。

(c)在 50%、70% 和 100% 乙醇中逐级脱水。

(d)用组织透明剂透明玻片。用 DPX 封盖玻片。如果使用盖玻片，必须用 #00 盖玻片，并且用最少的封固剂，以便使 100× 物镜有足够的工作距离。

27. 用 Giemsa 染色：

(a)将干燥的玻片浸入纯净的 Giemsa 染液中 1 min。

(b)用 pH 6.5 的 0. 01 mol/L 磷酸缓冲液将染液以 1 : 10 原位稀释 10 min。

(c)通过用水向上置换，除去染色液。不应将玻片取出或将染液倒掉，否则在染液顶部形成的浮渣将黏附在标本上。

(d)用流动的自来水彻底清洗玻片，直至颜色从乳胶中而不是细胞中除去。

1. 遵守当地处理放射性核素的规则。由于这些规则不同， 没有特殊的规定可利用。注意事项如下：戴手套， 不要在水平层流中工作， 使用具有吸收衬垫的浅盘以容纳任何意外溢出的液体， 在标有用于放射活性的盒或盘中孵育细胞，按照当地的规定处理放射活性废物。

2. 由于 ³H-单核苷酸的最终定位是 DNA ，毒性很高。