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        方案14.5 美希索中克隆培养

        相关实验:美希索中克隆培养

        最新修订时间:

        原理

        将细胞悬浮在含美希索的培养基中,将这种细胞种于铺有琼脂(或琼脂糖)凝胶底层的培养皿中。

        材料与仪器

        步骤

        1. 按照 14.4 实验中步骤 1~7 制备琼脂凝胶底层。

        2. 用等体积 2× 培养基(即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配2× 培养基,取半量所需终液量,加两倍浓度的血清)稀释美希索(1.6 %美希索,4 Pa-S(4000cps),以 UPW 溶解,置于冰上)至 0.8 % ,充分混匀,冰上保存。

        3. 胰蛋白酶消化单层贴壁细胞,收集悬浮细胞或骨髓细胞,计数。

        4. 制备以下稀释浓度的细胞,细胞的最高浓度为 1×105 /ml 。

        (a)1×105 /ml

        (b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml

        (c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml

        (d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml

        美希索有黏性,用不带针头的注射器更容易操作。

        5. 将四种稀释度分別标在 4 个小玻璃瓶或试管上,从每种稀释液中吸出 40 μl,包括 1×105 /ml 稀释液,分別放人相应容器内,再向每个容器中加 4 ml 0.8 % 美希索培养基,用漩涡混旋器充分混匀,如果细胞特别脆弱,用注射器(用于分装美希索。由于黏稠,美希索会附着于吸管内壁,造成分装量不准确)上下轻柔地抽吸溶液几次,然后用注射器再从每个容器中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下:

        方案14.5 美希索中克隆培养

        (a) 1×105 /ml/皿

        (b) 330 /ml/皿

        (c) 110 /ml/皿

        (d) 37 /ml/皿

        6. 将培养皿放置在加湿的温箱屮培养至集落形成。由于集落会在琼脂与美希索的界面形成,所以培养 1 周后添加新鲜培养基 1ml/皿或孔,2 周后在不影响集落的情况下,弃旧液,更换更多新鲜培养基。

        来源:丁香实验

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