方案14.4 琼脂中克隆培养

温度高时琼脂呈液态，但在37℃ 时成凝胶状态，细胞悬浮在温暖的琼脂凝胶培养基中，待琼脂形成凝胶后进行培养，形成散在集落，很容易分离。

1. 在培养皿底皿侧面编号或做好标记，将培养皿放在托盘中，很方便。

2. 准备含 40 % FBS 的 2× 培养基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配 2× 培养基，取半量所需终液量，加两倍浓度的血清），保持 37℃。

3. 称取 1.2 g 琼脂。

4. 分别在无菌锥形瓶和另一个无菌瓶中加 100 ml 无菌 UPW。将 1.2 g 琼脂放人锥形瓶中，盖好，煮沸 2 min 。另一种方法是，提前高温灭菌琼脂。但若已保存起来，使用时仍需煮沸溶解或微波炉融化备用。

5. 将煮沸过的琼脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。

6. 2× 培养基和 1.2 % 琼脂等量混合制备 0.6 % 琼脂底层，保持 37°C 。如果需要任何的生长因子、激素或其他添加物，应在此时添加至底层琼脂培养基（生长培养基，1×，用于细胞稀释）内。



7. 在培养皿中加人 1 ml 0.6 % 的琼脂培养基，晃匀，确保培养基覆盖整个培养皿底。置于室温定型。



8. 制备细胞悬液，计数。

9. 准备 0.3% 琼脂培养基，保持 37°C 。此培养基可以用 37°C 的 2× 培养基、55°C 的 1.2 % 琼脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制备。

10. 制备以下稀释浓度的细胞，使细胞的最大浓度为 1×10⁵ /ml。

(a)1×10⁵ /ml

(b)将 1×10⁵ /ml 稀释 3 倍成 3.3×10⁴ /ml

(c)将 3.3×10⁴ /ml 稀释 3 倍成 1.1×10⁴ /ml

(d)将 1.1×10⁴ /ml 稀释 3 倍成 3.7×10³ /ml

11. 将四种稀释液的浓度分别标在 4 个小玻璃瓶或试管上，从每种稀释液中吸出 40 μl，包括 1×10⁵ /ml 细胞液，分别放入相应容器内 37°C 加 4 ml 0.3% 琼脂培养基，混匀，再从每个容器（通用容器，小玻璃瓶或离心管，稀释细胞用）中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下：

(a)1×10³ /ml/皿

(b)330 /ml/皿

(c)110 /ml/皿

(d)37 /ml/皿

加细胞之前， 确保上层琼脂培养基有足够的时间冷却至 37°C 。

12. 待培养皿中的溶液在室温下形成凝胶状态。

13. 将培养皿放置在一个带盖的清洁塑料盒中，37°C 加湿温箱中培养 10 天。

准备培养基和细胞之前，先算出细胞稀释度，在培养皿上做好标记，检测一个细胞系的克隆形成率时，为每种稀释度的细胞分别准备3 个培养皿。每个3. 5 cm 培养皿适宜接种的细胞數是1000、333、111和 37 个。也就是依次 3 倍的稀释细胞悬液。如果需要加入生长因子、激素或其他添加剂，应加在下层的 0.6 % 琼脂中。

如果需要测定生长因子的活性滴度或选择不同因子，在铺底层琼脂之前向培养皿内加入所需量的因子。