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        方案14.3 饲养层的准备

        相关实验:饲养层的准备

        最新修订时间:

        原理

        接种同源或异源细胞—比如来自小鼠胚胎的细胞。待受测细胞克隆培养之前,中等密度,用射线照射或药物作用使其失去增殖能力。

        材料与仪器

        步骤

        1. 用胰蛋白酶消化原代培养的胚胎成纤维细胞(见方案 12.6、方案 13.2),以每毫升 105 个细胞再种入培养瓶中。

        2. 用以下其中之一的方法阻止进一步分裂:

        方案14.3 饲养层的准备

        (a)通过放射处理

        i)原培养瓶中,细胞暴露于 60 Gy 照射细胞,用 X-光机或 γ 射线源 如 60Co(X 射线或 60Co源,能在 30 min 或更短时间内释放 30 Gy (可以取代丝裂霉素C))。

        ii)消化后细胞悬液,细胞暴露于 60 Gy 照射细胞,用 X-光机或 γ 射线源 如 60Co。然后以 1×105 ml 接种,或将照射过的细胞保存在 4°C,最长到 5 天。

        (b)通过丝裂霉素 C (丝裂霉素C,100 μg/ml 储存液,溶于 HBSS 或无血清培养基中)处理

        i)以 0.25 μg/ml 将丝裂霉素加到接近汇合的细胞中,37°C 过夜(~18 h )[ Macpherson and Bryden,1971 ],更换培养基。

        ii)胰蛋白酶消化悬液 1×107 ml 中加人丝裂霉素 C,终浓度 20 μg/ml(相当于2 μg/106 个细胞),37°C 孵育 1 h ,离心清洗(4×10 ml) 去除丝裂霉素,再以 1×105 /ml 接种 [Stanley,2002 ] 或 4°C 保存,可到 5 天。

        3. 再培养 24~72 h 后,胰蛋白酶消化,再接种在新的培养基中。或直接接种保存的细胞。接种浓度 5×104 个细胞 /m l (104 个细胞 /cm2)。

        4. 继续培养 24~48 h,种入克隆培养的细胞。

        来源:丁香实验

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