乳腺上皮细胞培养

在内源性巨噬细胞存在的条件下，将经离心得到的哺乳早期的乳汁上皮细胞放入营养丰富的培养液中培养，并可用混合性蛋白酶螯合液传代。

材料

无菌

1. 生长培养液：RPMI 1640

2. 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)

3. 人血清（human serum: 血库过期的血清，澳大利亚抗原阴性）

4. 储存备用的液体：
(a) 1 mg/ml 胰岛素（Sigma)：用 6 mmol/L 盐酸配制；
(b ) 0.5 mg/ml 氢化可的松：用生理盐水配制；
(c) 50ug/ml 霍乱毒素: 用生理盐水配制。

注意事项

血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰酶和胰蛋白酶应在-20°C 条件下保存。

 

5. TEGPED： 胰蛋白酶液，含有下列成分
(a) 13 mmol/L EGTA (ethylene glycol-bis-(β-aminoethylether) -N，N，N‘，N'-tetraacetic acid，Sigma）：10 ml，用 D-PBSA 配制；
(b) 7 mmol/L EDTA（diaminoethane tetraacetic acid，Sigma): 4 ml, 用 D-PBSA 配制；
(c) 0.2% 胰蛋白酶（Difco,B-I) Bioscience): 4 ml, 用 HBSS 配制；
(d) 1% 胰蛋白酶（Difco ,B-D Bioscience): 2 ml，用 HBSS 配制。

6. 生长培养液：RPMI 1640, 添加 15% FBS、10% 人血清、50ng/ml 霍乱毒素

7. 0.5ug/ml 氧化可的松和 1ug/ml 胰岛素 

8. 50 mm Nunc 塑料培养皿或 25 cm² 培养瓶 

9. 普通容器或 20～50 ml 离心管

操作步骤

最好在医院病房于产后 2～7d 收集乳汁。用无菌水擦洗乳房，然后用手将乳汁挤入无菌容器。一般每个病人收集 5～20 ml 乳汁。将收集的乳汁混合后，用 RPMI 1640 稀释（1 : 1 ) , 以利于离心。

原代培养 

1. 将稀释的乳汁离心（600～1000 g，20 min) 后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应留有少量液体。

2. 用含有 5% FCS 的 RPMI 1640 清洗细胞 2～4 次，直至上清不浑浊。

3. 用生长培养液混悬细胞，将 5ul 细胞悬液加入 50 mm 培养皿（Nunc)。然后，加人 6 ml 生长培养液，在 37°C 和 5 % CO₂ 条件下培养细胞。

4.3～5d 后换培养液，以后每周换 2 次。6～8d 出现克隆，克隆细胞生长挤掉巨噬细胞。开始时，巨噬细胞起着饲养细胞的作用。

传代培养

5. 在 37℃ 条件下用 TEGPED (每个 50 mm 培养皿 1.5 ml) 孵育细胞 5～15 min。孵育时间根据细胞已培养时间而定。然后，混悬细胞。

6. 离心（100 g，5 min ) 后，用 6 ml 培养液混悬细胞。

7. 将细胞悬液分放入 50 mm 培养皿和 25 cm² 培养瓶，每 3 个培养皿或每个培养瓶 2 ml。

8. 加入 4 ml 新鲜培养液，将细胞悬液稀释 3 倍。