方案 24.1 汇合饲养层肿瘤细胞筛选实验

在指数生长中期，用丝裂霉素C处理饲养层细胞，将细胞培养形成汇合的单层。通过胶原蛋白酶消化从活检标本分离肿瘤细胞，或者用胰蛋白酶消化从原代培养物获得肿瘤细胞，然后将肿瘤细胞接种到汇合的单层上（图24.1）。上皮性肿瘤细胞可以在3周至3个月内形成克隆。纤维肉瘤和神经胶质瘤并不总是形成克隆，而可侵入饲养层，并逐渐过渡生长。

一、材料

无菌 

1. 饲养层细胞（如 3T3、STO、10T1/2 或 FHS74Int）

2. 1 mg/ml 丝裂霉素 C（Sigma）

注意：

首次使用饲养层细胞时，最好作丝裂霉素 C 的剂量反应曲线，证实这个剂量能使饲养层细胞存活 2~3 周，但使细胞最多进行两个倍增后不再继续增殖。在这种情况下，按如下步骤进行：
（1）将 25 cm² 培养瓶中的细胞用 1~100 μg/ml 丝裂霉素 C 处理过夜（18 h）；
（2）用胰蛋白酶消化细胞后，以 20 ml 新鲜培养液将培养瓶中的全部细胞再接种到 75 cm² 培养瓶中；
（3）将细胞培养 3 周，每周换液 2 次；
（4）将细胞染色，检查存活的克隆。

2. 生长培养液

3. 2000 U/ml 胶原蛋白酶，CLS 级（Worthington）或相当级别

4. 0.25% 胰蛋白酶，用 PBSA 配制

5. 肿瘤活检标本或原代培养物

6. 装有 22 号刀片的手术刀

7. Petri 培养皿，用于解剖，同原代培养中的 Petri 培养皿 

二、操作步骤

1. 在 6 个 75 cm² 培养瓶中，将饲养层细胞培养至 80% 汇合。

2. 加入丝裂霉素 C 至合适的终浓度，一般约为 5 μg/ml。

3. 用丝裂霉素 C 孵育细胞过夜（约 18 h）。

4. 移出含丝裂霉素 C 的培养液，用新鲜培养液浸洗细胞单层。

5. 将细胞进一步培养 24~48 h。

6. 用胰蛋白酶消化细胞，以 5X105 个/ml（1X105 个/cm²）的密度将细胞再接种到 25 cm² 培养瓶中。将细胞培养 24 h。

7. 如果使用活检标本，需将标本切开，第 2 步放入胶原酶中。

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8. 将从标本获得的细胞悬液以 20~100 mg/瓶接种到两个 25 cm² 培养瓶中，每瓶含 6 ml 细胞悬液。从每个培养瓶中取出 1 ml 悬液，分别放入另外两个培养瓶中，加培养液至 4 ml。第 3 对培养瓶作为对照，检查丝裂霉素 C 处理后饲养层细胞的存活能力。