方案23.6 大鼠肝细胞分离实验

经肝门静脉或肝门静脉分支插管，用无钙缓冲液灌洗肝 15 min，再用酶溶液灌洗 15 min。收集和洗涤细胞，计数有活力的肝细胞。

一、材料

1. 无菌

（1）L-15 Leibovitz 培养液 

（2）Ham F12 培养液或 WilliamE 培养液：80～100 ml，含有 0.2% 牛白蛋白（V 级，Sigma) 和 1 ug/ml 牛胰岛素 

（3）胞培养液（hepatocyte minimalmediu，HMM )：67.5% EMEM 和 22.5%199 培养液，或用 William E 培养液代替这两种培养液。添加 5ug/ml 牛胰岛素、lmg/ml BSA、20 mmol/L 丙酮酸钠、100U/ml 青霉素、100 Mg/ml 链霉素和 20%FBS

（4）HMM/SF：无血清 HMM ，添加 10^-5mol/L 氢化可的松半琥珀酸酯 

（5）无钙 HEPES 缓冲液：含有 160.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl、0.7 mmol/L Na2 HPO_4·12 H₂O 和 33 mmol/L HEPES，pH 7.65。用 0.22, 又微孔滤器过滤除菌，在 4℃ 条件下储存，可存放 2 个月 

（6）胶原蛋白酶液：含有 0.025% 胶原蛋白酶（I 级，Sigma; 或 Boche，103578) 和 0.075% CaCl2·2 H₂O，用 pH 7.65 的无钙 HEPES 缓冲液配制。使用前配制，并用滤器过滤除菌 

（7）5% 戊巴比妥钠（Abbott)

（8）肝素（Roche)

（9）聚乙稀管：内径为 3 mm ，外径 5 mm

（10）一次性 20 G 头皮静脉输液针（Dubernard Hospital Laboratory，Bordeaux，France)

（11）插管用的缝合线 

（12）刻度瓶和 Petri 培养皿 

（13）手术器械：尖剪、直剪、弯剪和手术夹 

（14）2 支二次性 1 ml 注射器

2. 非灭菌

（1）计时器 

（2）蝠动泵：10～200r/min

（3）水浴箱

二、操作步骤

1. 用水浴箱将 HEPES 缓冲洗液和胶原蛋白酶液预热，一般 38～39℃，进人肝内时为 37℃。不需要加氧。

2. 将螺动架的流速设定在 30 ml/min。

3. 腹膜腔注射戊巴比妥钠（每 100 g 体重注射 150ul)，将大鼠（180～200 g ) 麻醉。然后，经股静脉注射 10001U 肝索。

4. 用 70% 乙醇擦洗大鼠腹侧面。

5. 切开腹壁，在离肝约 5 mm 处将结扎线系于肝门静脉上。朝肝的方向插管后，结扎肝门静脉。

6. 为了避免压力过高，迅速剪开肝静脉。以流速 30 ml/min 灌注 500 ml 无钙 HEPES 缓冲液。几秒钟内确认肝变白。

7. 以流速 15 ml/min 灌注 300 ml 胶原蛋白酶液。肝变得肿胀。

8. 切除肝，用 HEPES 缓冲液冲洗。

9. 剥离 Glisson 囊后，用 100 ml L-15 Leibovitz 培养液分散细胞。

10. 用两层纱布或孔径为 60～80um 的尼龙网过滤细胞悬液。通常在室温条件下，让有活力的细胞沉淀 20 min 。然后，吸去 60 ml 含有细胞碎片和死细胞的上清液。

11. 通过缓慢离心（50 g，40s) 洗细胞 3 次，以除去胶原蛋白酶、损伤细胞和非实质性细胞。

12. 用 HMM 混悬分离的肝细胞。

13.2～3 h 后，活细胞会贴壁，并开始伸展。吸去含有死细胞的上清液。

14. 细胞贴壁后，用 HMM/SF 替代含有 FBS 的 HMM。此后，每天换培养液。