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        方案22.3 贴壁细胞的克隆形成实验

        相关实验:贴壁细胞的克隆形成实验

        最新修订时间:

        原理

        用不同浓度的实验试剂将细胞处理24h 。经胰蛋白酶消化后,以低细胞密度接种,温育1~3 周,染色后(见彩图6a,e) 计集落数(图22.1)。

        材料与仪器

        步骤

        材料

        无菌

        生长液
        D-PBSA
        0.25%粗制胰蛋白酶
        待测化合物配制成最大使用浓度的10倍,溶于无血清生长液中;检査试验溶液的pH 和渗透压,若需要的话,予以调整;
        培养瓶,25cm2
        培养皿,6cm 或9cm,在底皿的边上做标记

        非灭菌

        D-PBSA
        甲醇
        1 % 结晶紫
        血细胞计数板或电子细胞计数器

        操作步骤

        1. 准备一系列在25cm2的培养瓶中培养的细胞,6 组试剂浓度,每组各3 瓶,另有3 组作对照。在每个培养瓶中接种4.5 ml 细胞悬液(细胞密度为每毫升生长液5X104个细胞),温育48h ,届时细胞将进入对数生长期(见21. 9.2 节)。

        2. 制备一系列待测物质的稀释液,每组2ml,为所需终浓度的10倍:

        (a) 若是首次测试的化合物,在3~5 个对数生长范围内采用5 倍稀释;
        (b ) 若是能够预测大致的毒性浓度,那么就选择一个较窄的算术范围,每组相隔10或20 数量级。

        3. 在每组浓度的3 个培养瓶中各加人0.5 ml 10倍浓度的待测化合物,使其稀释10倍。先从对照组(不含待测物质)开始,然后从低浓度向髙浓度进行。

        4. 将培养瓶放回孵育箱。

        5. 若化合物作用缓慢或可部分逆转,那么重复第3 步两次,也就是将细胞暴露在试剂中3 天,每日更换培养基及化合物,这样培养基及待测化合物即可得以更新。对于快速作用的化合物,暴露1h就已足够。

        6. 依次将每组3 瓶中的生长液倾去(从最低浓度向最高浓度进行),用胰酶消化细胞。

        7. 将细胞稀释至克隆生长所需的密度(见方案14.1),接种于培养皿中。以与对照组相同的数量稀释所有细胞,从最高浓度的培养瓶至最低浓度组,最后稀释对照组。

        8. 温育细胞直至集落形成。

        9. 用无水乙醇固定细胞,用1% 结晶紫染色10min (见方案16.3)。

        10. 用自来水清洗培养皿,吸去水分,倒置干燥。

        11. 对多于50 个细胞的集落(多于5个世代)进行计数。生长曲线的分析

        12. 计算每组药物浓度下的细胞贴壁效率。

        13.计算相对贴壁效率:每组浓度的贴壁率/对照组的贴壁率,这是细胞存活分数。

        14. 依据所用的的浓度范围,在对数或线性药物浓度下,绘制细胞存活分数曲线图(图22.2)。

        15. 确定IC50或IC90,它们分別是50% 或90% 的集落形成被抑制时的化合物浓度。由于这是一个半对数曲线图,IC90更为适用,因为它更可能落在曲线的线性部分;而IC50。往往落在曲线的弯曲部分,这样它的稳定性就比较差。

        16.敏感性差异曲线的分析:
        (a) 曲线的斜率和弯曲部分的长度。曲线的斜率较浅和/或弯曲部分较长表示敏感性降低;斜率较陡和/或弯曲部分较短表示敏感性增加。弯曲部分的长度及斜率对IC50和IC90均有影响,而在IC90可以观察到更显著的差异(图22.3),并且IC90常作为一个简单的导数;
        (b) 抗性分数。细胞抗性分数是指曲线下端的平坦部分;
        (c) 缺乏曲线梯度则表示所有细胞均有抗性;
        (d) 曲线下面积:复杂的生存曲线可以通过计算曲线下的面积进行比较,但这样做只是为了方便,从数学上来讲并不是很有根据。

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        <center> <div> <a href="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/23/42/47593909.jpg" target="_blank"><img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/23/42/47593909.snap.jpg" /></a></div> </center>
        方案22.3 贴壁细胞的克隆形成实验

        来源:丁香实验

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