方案21.10 贴壁效率的测定实验

以低密度接种细胞，温育直至集落形成，染色与计数集落

材料

无菌

生长液 400 ml


0.25% 粗制胰蛋白酶 10 ml

Petri 培养皿，6 cm 20 个

试管或通用玻璃容器，稀释用 20 个

非无菌

血球计数板或电子计数仪

固定液：无水甲醇 100 ml

D-PBSA 200 ml

染料：结晶紫 100 ml

滤斗和滤纸（过滤染料）

操作步骤：

1. 胰蛋白酶消化细胞（见方案 13. 2)，制成单个细胞悬液。

2. 当细胞正在消化时:

(a) 在培养皿底面编号；
(b) 计算好每稀释步骤所需培养液（图 21.10)。培养液要足以有重复三次的最终稀释量。

3. 当细胞变圆并开始浮起时:

(a) 在含有血清或胰蛋白酶抑制剂的培养液中分散单层；
(b) 细胞计数；
(c) 将细胞稀释至：

i) 2X10⁴ 个/ml 加人两个 25 cm² 培养瓶中，用于常规维持。
ii) 稀释液最高浓度为 2X10³ 个/m l。
iii) 将 ii) 稀释成 5 种浓度，200，100, 50,20 和 10 个/ml。

4.将五种浓度（iii) 的细胞以5ml 培养液接种于Petri培养皿中。另外在两个6cm 的Petri 培养皿中加入2 X 10³ 个/ml作为对照，以防克隆培养不成功(至少要保证在最大稀释的培养液中有细胞）。

5. 将培养皿中充 5 % CO₂ 并置于温箱中。

6. 将Petri培养皿放入透明的塑料盒内，最好将盒放人限制通道人口并只用作克隆实验的潮湿的CO₂ 温箱中。

7. 温育1～3 周直到肉眼可见集落。

8. 用结晶紫染细胞：

(a) 将培养皿中的培养液吸走；
(b) 用D-PBSA 清洗细胞，弃掉洗液；
(c)加入5ml新鲜D- PBSA ，然后加人5ml 甲醇轻柔混匀（小心避免集落漂起来）；
(d)以新甲醇5ml取代甲醇D-PBSA 混合液（50:50)，固定细胞lO min；
(e)弃去甲醇，加人过滤过的结晶紫，每6cm 的培养皿2～3ml, 要确保整个生长面被染料覆盖；
(f) 染色 lO min。
(h) 撤去染料，过滤后倒人母液瓶中。

9. 计数每个IE 中的集落数，集落中少于50 个细胞的不用计数。放大镜下观察更容易计数。定出一个阈值很为重要，阈值以上者可算作集落，如果大多数的集落在100个和数f 个之间，则每个集落的设定阈值可以是50个细胞。在操作中，用肉眼进行计数是普遍的。然而，当集落数非常小（<100个细胞），则每个集落的设定阈值可以是16个细胞。16个细胞以下者即相当于4 次细胞连续分裂，则很难会有更多的细胞增殖。