方案21.7 培养瓶中单层培养细胞生长曲线的绘制实验

开始一系列的培养，每天在一定的时间计数细胞直至它们到达平台期。

材料

无菌
单层细胞培养，A549,Vem 或 HeLa-S3, 75 cm² 培养瓶，晚对数期 1 瓶

0.25% 粗制胰蛋白酶，混合有 lOmmol/L EDTA 5 ml

生长液，含 2 mmol/LNaHC0₃ 200 ml

D-PBSA(用于清洗和细胞计数）50 ml

25 cm² 培养瓶 24 个

操作步骤

1. 对于一般的传代，先用胰蛋白酶消化细胞（见方案 13.2)。

2 . 稀释细胞悬液分别至 2X10⁴ 个细胞/ml，150 ml 培养基。

3 . 接种于 24 个 25 cm² 培养瓶。

4． 封好培养瓶，然后置于 37°C 温箱内。

提示 用低碳酸盐（4 mmol/L) 培养基对本方案有方便之处，如果碳酸盐浓度过高（如 23 mmol/L ), 则通入 5% C02 或置于 C02 孵箱中，用透气性盖子。

5. 24 h 后，从温箱中取出第一次的 2 瓶细胞，计数细胞数：

(a) 将每瓶培养液完全吸掉；
(b) 每瓶加入 2 ml 胰蛋白酶/EDTA；
(c) 温育培养瓶 15 min；
(d ) 用胰蛋白酶/EDTA 将细胞分离下来，取 0.4 ml 细胞悬液至 19.6 ml 的 D-PBSA 中以备计数；
(e) 用电子细胞计数仪计数细胞。

6 . 如第 5 步，在 4、8 和 72 h 时重复取样。

7 . 于 72 h 时或者更早一些时间换培养液，这可依据 PH 的下降来决定（见方案 13.1 ; 彩图 22b )。

8. 对于迅速生长的细胞（即 PDT 为 12～24 h 的细胞）可以每天连续取样，但是对于生长缓慢的细胞（也就是 PDT > 24 h )，则每两天取样，直至细胞达到平台期。

9 . 依据 pH 的改变，每 1、2 或 3 天换培养基。

10．于 2 、5、7、10 天取一个培养瓶染细胞（见 16.4.2 节）。

提示 也可以用血球计数板进行细胞计数，但这对于细胞浓度较低者尤其在生长曲线的开端比较困难。如果要用血球计数板，可将胰蛋白酶的容积减少至 0.5 ml，小心地用微吸管将细胞分散，使之不产生气泡， 然后将细胞移至血球计数板。