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        接种存活率和克隆形成率法

        相关实验:细胞增殖生长方面实验

        最新修订时间:

        原理

        细胞被制成分散的悬液后,以低密度(2~5 个细胞/cm2)被接种到底物上,贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值称接种存活率,用以表示细胞群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆(通常为16~50 个细胞)形成情况,又因每个克隆都来自一个细胞,因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比。
        接种存活率和克隆形成率法
        如细胞冻存复苏后接种再培养时,常测定细胞接种率(Seeding Efficiency),即接种后细胞贴壁数。

        接种存活率和克隆形成率法
        细胞接种率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,从而细胞接种率和细胞接种存活率不完全相同。接种存活率在意义上虽与克隆形成率相同,但隆形成率概念更明确。形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞,因此用克隆形成率一词表示细胞活力更为准确。

        克隆形成率与众多因素相关;从条件来说与底物、培养液、血清的量和质等有关;也受温度和pH 的影响。从细胞方面,克隆形成率反映细胞的两个重要性状,即群体依赖性和增殖能力。一般初代培养细胞弱,传代细胞系强;二倍体细胞弱,转化细胞系强;正常细胞弱,肿瘤细胞强。即随细胞生物学性状的不同,细胞克隆形成率差别很大;另外所有细胞的克隆形成率又受接种细胞密度的影响。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、冻存技术不良或细胞生活力弱时可降低接种存活率

        为获得确切的接种存活率,接种时一定要接种分散为单细胞悬液。一般情况下把细胞直接接种在碟皿中即可。细胞接种密度和克隆形成率有一定关系。做克隆率测定时,一般持续一周,期间随时检查,到细胞形成克隆时终止培养,固定染色。

        1.  细胞

        80 %~90 %汇合细胞;

        2.  悬液制备

        用消化法制备成单细胞悬液,接种到适宜底物(玻璃或塑料瓶皿);用多孔塑料板亦可(每孔底面积不宜小于1mm2);

        3.  培养

        置温箱中培养;

        4.  观察

        隔48~96 小时,见细胞克隆已形成,终止培养;1:3 醋酸甲醇固定、Giemsa染色、镜下观察、计算克隆数。

        二、软琼脂培养

        特别是双层软琼脂培养,仍为当前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法,与细胞恶性程度有很大的符合率。

        1.  琼脂制备

        用三蒸馏水分别制备出1.2 %和0.7 %两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40 ℃中勿令凝固;

        2.  无菌制备出2xDME(含有2x抗生康和20%的小牛血清),保存在37 ℃中;

        3.  底层琼脂制备

        按1:1混合1.2 %的琼脂糖和2×DME后,取3 ml 混合液注入直径6 cm平皿中(如为10 cm平皿则加7~10 ml),令冷却凝固、置CO2温箱中备用;

        4.  消化细胞

        用营养液制成细胞悬液、计数;

        5.  顶层琼脂制备

        按1:1 比例让0.7 %琼脂和2xDME在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2 ml的细胞悬液,充分混均、注入已铺有1.2 %琼脂糖底层平皿中(直径6 cm 平皿加3 ml;10 cm平皿加7~10 ml),遂形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37 ℃CO2温箱中,培养10 天~14 天;

        6.  观察细胞集落。

        注意事项

        1.  确定克隆无绝对标准,一般情况下不能少于8 或10 个以上的细胞群才算作一个克隆;克隆检测宜用低倍镜,用解剖镜检查甚好。

        2.  制备细胞悬液要求一定做到为单细胞,如分散不好,有很多两个以上的细胞团,接种后可导致克隆形成不均,将出现人为误差。

        3.  接种密度不能过大,在细胞过密情况下,细胞克隆相互界限不清或易发生早期汇合。

        4.  琼脂与细胞相混时,温度不宜超过40 ℃以免烫伤细胞。

        5.  接种细胞密度每平方厘米最好不超过35 个;在直径6 cm的平皿应接种细胞1000 个。

        6.  上层琼脂中含有细胞,因琼脂为半流体,细胞悬于琼脂中不下沉;如分散和混合良好,则细胞被均匀互相隔离;因两层琼脂中都含有DME,细胞可获充分营养进行增殖生长。

        7.  由于细胞被相互隔离,孤立存在,消除了细胞相互影响,对细胞依存性大的细胞增殖生长不利;肿瘤细胞独立生存性强,仍能形成克隆。

        来源:丁香实验

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