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        β-半乳糠苷酶检测

        相关实验:酵母载体与表达产物的检测实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  按每一个单酵母菌落接种YPD(或适当)的培养基,挑2~3个含lacZ融合蛋白表达质粒的酵母菌于30℃培养过夜,如果融合蛋白在一个质粒上,那么就在选择该质粒的培养基中培养。
         
        2.  在5 ml 培养基中(或用适当的选择培养基和诱导条件)接种20~50 μl 过夜培养的培养液。培养细胞至对数生长的中期或晚期:丰富培养基,0.5~1×106细胞/ml 或极限培养基, 2~5×107细胞/ml(OD600=0.5~1.0)。
         
        3.  培养液1 100 g 离心5 min 收集细胞,用等体积的Z缓冲液重悬菌体,并置于冰浴中, 检査每份样品的OD600值。
         
        4.  每个样品设二个反应管(每管1 ml):

        (1)100 μl 细胞悬液与900 μl Z缓冲液混合。

        (2)50 μl 细胞悬液与950 μl Z缓冲液混合。
         
        5.  在每个样品反应管中,用巴斯德吸管滴加1滴0.1%SDS和2滴氯仿,旋涡振荡10~15 s,在30℃水浴中平衡15 min。
         
        6.  加入0.2 ml 4 mg/ml 的OPNG,在旋涡混合器上振荡5 s,置30℃水浴中,并开始计时。

        7.  当溶液变黄(OD420=0.3~0.7)时,加入0.5 ml 1 mol/l Na2CO3中止反应,记录下中止反应的时间。
         
        8.  1 100 g 离心细胞5 min 测定上清的OD420和OD550

        9.按下列公式计算半乳糖苷酶的活性(单位U)
         
        β-半乳糠苷酶检测

        来源:丁香实验

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