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        混合淋巴细胞培养

        相关实验:混合淋巴细胞培养实验

        最新修订时间:

        原理

        两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时,由于HLAⅡ类抗原不同,可相互刺激对方的T细胞发生增殖,此外双向混合淋巴细胞培养(two way MLC);若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力,但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化,称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。两个个体间HLA抗原差异程度越大,反应越强烈,可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原,常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

        材料与仪器

        步骤

        1.  刺激细胞的准备

        常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞(如N23细胞)或PBMC。

        (1)取处于对数生长期的N23细胞,离心后重悬于新鲜完全培养基中。

        (2)调整细胞数为1×10/ml~2×10/ml,移置于塑料培养瓶或者50 ml 离心管中。

        (3)用60 ℃照射3000 rad。

        2.  反应细胞的准备

        分离纯化待检个体的PBMC。

        3.  LC

        (1)按2×106PBMC与1×105经3000 rad照射的N23细胞的比例,重悬于4 ml 10%FCSRPMI1640。

        (2)放置于小培养瓶中进行MLC,培养瓶保持直立,培养4 d 内不要晃动。

        (3)第5 d 加入1 ml 新鲜培养基。

        4.  如要测定3H-TdR掺入率,一般可在MLC的第5 d 进行。

        5.  如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞(CTL),一般在7~10 d 左右收获效应细胞。

        注意事项

        1.  注意无菌操作。

        2.  刺激细胞接受照射剂量要准确,是细胞暂时存活,但失去增殖的能力。

        3.  可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞,也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。

        4.  不同刺激细胞与反应细胞的合适比例有所不同,应做预实验选择最佳的实验条件。

        来源:丁香实验

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