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        双向琼脂扩散

        相关实验:琼脂扩散实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  取一清洁载玻片,倾注3.5~4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。

        2.  凝固后,用直径3毫米打孔器,孔间距为5毫米。孔的排列方式如图2所示。
        双向琼脂扩散
        图2 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
        3.  用微量进样器于中央孔加抗体,于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结果。

        4.  加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24~48小时。

        5.  结果观察:若凝胶中抗原抗体是特异性的,则形成抗原—抗体复合物,在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线,为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合,才能确定待检样品为真正阳性。

        6.  结果分析:琼脂扩散结果受许多因素影响。

        (1)抗原特异性与沉淀线形状的关系:在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时,则可出现两单沉淀线的融合。反之,如相邻抗原完全不同时,则出现沉淀线之交叉;两种抗原部分相同时,则出现沉淀线的部分融合。见图3。
        双向琼脂扩散
        图3 双扩散试验结果示意图
        A:已知抗体  a、b:阳性对照
        c、d、e、f:被检材料
        (2)抗原浓度与沉淀先导形状的关系:两相邻抗原浓度相同,形成对称相融合的沉淀线;如果两抗原浓度不同,则沉淀线不对称,移向低浓度的一边。见图4。
        双向琼脂扩散
        图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系
         a、b:抗体  A、A’、B:抗原
         A、B完全不同 A、A’部分相同
                           (3)温度对沉淀线的影响:在一定范围内,温度扩散快。通常反应在0~37℃下进行。在双向扩散时,为了减少沉淀线变形并保持其清晰度,可在37℃下形成沉淀线,然后置于室温或冰箱(4℃)中为佳。

        (4)琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响:一般来说,琼脂浓度越大,沉淀线出现越慢。

        (5)参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响:抗原、抗体相距越远,沉淀线形成的越慢,所以在微量玻片法时,孔间距离以0.25~0.5 cm 为好,距离远影响反应速度。当然孔距过远,沉淀线的密度过大,容易发生融合,有碍对沉淀线数目的确定。

        (6)时间对沉淀线的影响:沉淀线形成一般在1-3天出现,14-21天出现的数目最多。玻片法可在1~2小时出现,一般观察72小时,放量过久可出现沉淀线重合消失。

        来源:丁香实验

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