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        测定N-末端封闭蛋白质的内部序列

        相关实验:蛋白质的微量测序分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  电泳分离目标蛋白并转移到硝酸纤维素膜。
         
        2.  将硝酸纤维素膜放入盛有50 ml 含0.1%丽春红S料的1%乙酸水溶液的经酸洗的petri 玻璃培养皿。轻轻摇动1 min。

        3.  将膜移入1%乙酸1 min,如有需要,换液至条带显迹清晰。
         
        4.  穿带无粉尘手套用刀片将目标蛋白条带切下,小心切去多余的硝酸纤维素膜后,放入微量离心管中,取一片空白膜作对照。
         
        5.  将膜放入1 ml 0.2 mmol/l NaOH中,振荡1 min 脱色,吸去NaOH。

        6.  立即加入1 ml 含0.5%PVP-40的0.1 mol/l 乙酸中,室温下轻轻摇动管子30 min。

        7.  吸去PVP-40,用1 ml 水洗膜5次。小心除去留于管帽下的任何液滴。
         
        8.  用清洁的细头镊子将膜片转移到干净的玻璃表面(如经酸洗的玻璃平板或petri培养皿),切成1~2 mm 的小片,用镊子收集膜片,挤去过量的液体。

        9.  立即将膜的碎片移入盛有25 μl 消化缓冲液的0.5 ml 微量离心管中,加入1 μl 1 mg/ml 的胰蛋白酶,混匀使膜均匀地泡于溶液中,室温放置过夜。
         
        10.  室温高速微量离心1 s,回收粘在管壁和盖子上的液滴。

        11.  室温超声处理样品5 min。
         
        12.  室温用最大速度微量离心1 min 将上清移入离心过滤装置,用100 μl 消化缓冲液洗膜碎片,合并于上清,在最大速度微量离心样品20~30 s。
         
        13.  用95%层析A液 / 5%B液,以0.15 ml/min 的流速平衡2.1 mm×250 mm 的反相HPLC柱,有层析炉可用吋,在60℃进行以优化分辨效果。

        14.  注射样品,用95%层析A液 / 5%B液洗柱子10~15 min。
         
        15.  用如下的梯度洗脱多肽:5%~40%B液1 h 以上,40%~75%B液30 min 以上,75% ~100%B液15 min 以上,在215 nm 监测多肽的洗脱。
         
        16.  用图形记录仪根据全量程的波型调整至0.05~0.1 AUFS监测多肽洗脱峰的出现。
         
        17.  当图型记录仪开始摆动说明有洗脱峰出现时,对准一干净的表面擦毛细管的尖,用微量离心管收集分部组分。
         
        18.  立即盖好盖子,置于干冰或于-70℃贮存。
         
        19.  加样于按Applied Biosystems所述方法经Polybrene预处理的玻璃纤维滤膜支持体中,进行测序。

        来源:丁香实验

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