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        基本方案

        相关实验:蛋白质回收实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  凝胶浸泡在染色液中于室温缓慢摇动染色15~20 min,然后移至脱色液中于4℃温和摇动下脱色2~3 h。

        2.  切下染色后的凝胶条带,于4℃水中浸泡2~3 h,期间换几次水。然后分别将每条胶移入Petri培养皿中,加入10 ml 水覆盖之,并将它们捣碎成约1 mm3的碎片,再用巴斯德吸管将水吸千。
         
        3.  用一园片状的Spectrapor 6透析膜将电洗脱仪的洗脱池的底端盖好,并拧紧帽子
         
        基本方案
        图一、洗脱池

        4.  将捣碎的凝胶移入洗脱室的粗大的一端,并以浸泡缓冲液覆盖,在浸泡液之上,加入一层冼脱液,使之刚没过水平隧道,排除气泡。
         
        5.  将洗脱室置于洗脱池之内,加入洗脱液至仅高于各电极槽的排液出口, 将其余的液体加入小混合池中。
         
        6.  连接双通道蠕动泵,调整流速使溶液能缓馒地从混合池中滴回洗脱池。用弯头巴斯德吸管吸去洗脱室透析膜下的所有气泡,小心不要戳穿透析膜。
         
        7.  将凝胶碎片浸泡3~5 h。连接电极,注意将阴极连接于冼脱室有凝胶碎片的一侧。50 V 恒压12~16 h。
         
        8.  关电源,撤去与电极的连接,以透析液代替洗脱罐中的冼脱液。重新连接电极,在80 V 恒压下12〜24、
         
        9.  关电源,撤去与电极的连接,关闭蠕动泵。从罐中取出洗脱室,吸去含洗脱蛋白的收集池中蓝色蛋白层上面的缓冲液,以带平嘴针头的50 μl 注射器混匀剩余的含蛋白液体。
         
        10.  将蛋白溶液移入一微量离心管中,用50 μl 透析液洗收集池,并合并于蛋白液。
         
        11.  在Speedvac蒸发器中冻干液体,样品可在-20℃保存。
         
         
        基本方案
        图二、洗脱仪及洗脱池

        12.  样品用100 μl 水重溶,并以50:50甲醇/丙酮沉淀。-20℃过夜,微量离心沉淀蛋白。
         
        13.  取5%~10%样品用Laemmli凝胶系统的微型胶分折蛋白冼脱的程度、分子量和回收率,蛋白质可用考马斯亮蓝或银染法检测。

        14.  将剩余的样品加样于浏序滤膜,用于蛋白质序列分析。

        来源:丁香实验

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