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        基本方案

        相关实验:噬菌体克隆的纯化实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  在直径82 mm LB平极上倒入含200 μl 宿主菌的3 ml 0.7%顶层琼脂糖,放置10 min。
         
        2.  通过放射自显影胶片上的杂交斑点确定阳性噬斑在原平板上的位置,用牙签轻轻插入斑中。

        3.  然后接种到步骤1制备的次级平板的顶层琼脂糖中,此牙签在平板上接连插30~40下。
         
        4.  或用吸管插入阳性噬斑的位置,取一小块环形琼脂糖转入1 ml SM中。

        5.  加入1滴氯仿,放置1~2 h,滴定,制备3~6个平板,每个平板的噬斑数应小于500个。

        6.  次级平板置37℃过夜培养,将噬菌斑影印到硝酸纤维素滤膜上。

        7.  再依次处理、杂交、洗膜和曝光,然后在次级平板上找出对应的阳性噬菌斑。

        9.  对每个克隆,将牙签插入杂交信号最强的噬菌斑中,并在1 ml SM中放置5 min。

        10.  将1 μl 噬菌体贮存液。1 μl 和10 μl 1:100稀释液铺三级平板。

        11.  按以上步骤筛选第三级平板上的噬斑。

        12.  重复这一纯化过程,直至获得纯的噬斑为止,并将纯的噬菌体保存在SM中。

        来源:丁香实验

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