• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        胰蛋白酶消化法

        相关实验:大鼠星型胶质细胞培养实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、分离大鼠胚胎(16-18周)新皮层,置于L-15(或Hank's平衡盐/DMEM溶液,无Hepes)培养基中,除去脑膜和血管、海马、尾核和其他非皮层组织。

        二、 用解剖刀将其切成1 mm3大小的组织块。

        三、用1ml枪头转移250 ul 胶原酶储存液(1.33%,溶于L-15中)到1 ml的L-15(或D-MEM)中。每2只鼠脑组织块使用1-1.5 ml稀释胶原酶液。

        四、37℃水浴中孵育30 min。

        五、1 000 rpm(大约230g)中离心5 min,或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。

        六、去上清。

        七、在含EDTA-CMF的溶液中重悬细胞,并与胰蛋白酶以1:4~1:10比例混合。可以根据观察到的细胞消化的情况,适当调整两者的比例。

        八、加入胰蛋白酶的抑制剂和DNase溶液,混合5分钟。

        九、1 000 rpm(大约230 g)中离心5 min,或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。

        十、去上清。加入500 ul D-MEM-BS。

        十一、轻轻吹打成单细胞悬液,开始用5 ml枪头吹打10次,在需要时用18-gauge的针头吹打。( 注意:不要产生气泡。)200目/300目尼龙网过滤。

        十二、将细胞转移到含10%FCS-DMEM的培养瓶中,培养密度为2X106/25 cm2培养瓶,4~6 X106/75 cm3培养瓶。在37.2℃,37.5%中培养。

        十三、第2天换液,以后每隔3天换液。

        十四、7-10天,细胞发生融合。

        十五、细胞融合后,将瓶盖用封口膜密封好,在轨迹摇床上培养,旋转速度以不产生气泡为宜。37℃振摇过夜。细胞注意避光。

        十六、去上清,加入新鲜10%FCS-DMEM。

        十七、加入200 ul 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培养基。在37.2℃,37.5%中培养孵育48小时以消除分裂的细胞。

        十八、换用新鲜10%FCS-DMEM,孵育恢复24小时。

        十九、重复17-18步骤,消除所有的分裂细胞。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序