皮下移植块原位移植法

一、昆明小鼠皮下移植瘤传代

S180 细胞注人小鼠腹腔内， 进行体外培养，5 -7 d 可见小鼠腹部肿胀，有腹水，收集腹水， 细胞计数，调整细胞密度在2 x 10⁶- 2x 10⁷注射到昆明小鼠的腋部皮下形成实体瘤。待肿瘤生长至直径1.5 -2.0 cm 之间，处死小鼠，按上述方法反复传3 代后作为原位移植用瘤源。
 

二、 原位移植模型的建立

1.  取一中传3 代后生长4 周左右处于对数生长期的昆明小鼠， 常规消毒，从腋部皮下剥取肿瘤组织。

2.  剔除纤维包膜、血管，切开去除中间坏死的组织，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，剪成约1-2 mm ，小块备用。

3.  昆明小鼠术前禁食12 h， 以0.5% 戊巴比妥钠腹腔内注射(50 mg/kg)麻醉， 固定小鼠，常规消毒皮肤，用手术剪刀在小鼠沿左侧腹部正中旁线切开，切口约1.5 cm ，小心暴露腹膜、胃壁，用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆膜层， 以出血为度，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹完，植入1 块1-2 mm³ 瘤组织块，并在瘤表面滴1 滴OB生物胶， 使其覆盖瘤组织表面， 然后分层关腹。

4.  人胃癌组织块昆明小鼠原位种植后， 逐日观察裸鼠全身状况，运动情况，腹部体征。若实验过程中出现动物死亡，记录时间， 并全面探查腹腔，观察胃肿瘤原位生长情况。

三、 处死动物及移植瘤的观察
 

定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、腹部体征、移植后脱颈处死解剖，取原位瘤。所取标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，做组织病理学检查。
 

四、免疫组化染色
 

1.  采用EnVision免疫组织化学技术检测VEGF蛋白表达。EnVision是一种两步法免疫组化新技术，具有简便、特

异和敏感等特点。

2.  操作步骤如下，选取薄(3-4 um)而平整的组织切片，浸二甲苯脱蜡， 梯度酒精水化后微波修复抗原，室温冷却后PBS 洗涤5 min。

3.  切片放人H₂O₂液中封闭10 min，PBS 洗涤5 min，滴加1:100稀释的抗VEGF抗体置于37 ℃ 恒温孵育60 min，PBS 洗涤5 min。

4.  滴加二抗置于37℃恒温孵育30 min，PBS 洗涤5 min。

5.  DAB显色液显色，室温下染色时间约8-20 min，在显微镜下根据颜色的发展掌握染色时间。

6.  显色结束后放人PBS 洗涤5 min，苏木素复染，封片。

7.  以PBS 代替一抗为阴性对照。

8.  VEGF阳性结果判断：随机取5 个高倍视野，以其阳性细胞百分比计，≤5 % 为阴性(+) ，6%-25 % 为弱阳性( + ) ，26%-50%为中等强度阳性( + + )，≥51 % 为强阳性( ++ + ) 。

五、 移植瘤微血管密度的测定
 

1.  采用EnVision 法，方法同4 ，一抗为兔抗鼠CD31 抗体，稀释倍数为1：10 0 。

2.  用PBS 代替一抗作为阴性对照。

3.  移植瘤MvD 按照Weidner等的评判标准， 计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管， 凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为1 个血管计数，但肌层较厚及管腔面积大于8 个红细胞直径的血管不计数。

4.  首先在100x 镜下寻找血管数目最高的区域， 然后在200x 镜下计数5个区域中的微血管数目，取均值代表。

六、 统计学处理

移植瘤MVD资料用无士SD 表示，采用t 检验。