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        液相色谱-串联质谱法

        相关实验:液相色谱-串联质谱法测定尿液中的内源性类固醇激素

        最新修订时间:

        原理

        尿样经葡萄糖醛酸甙酶酶解后进行液-液提取,以甲醇-0.1%甲酸缓冲液(含0.02mol/L乙酸铵)(体积比为68∶32)为流动相,采用CosmosilC18色谱柱分离,并以三重四极杆串联质谱多反应监测扫描方式对尿样中的脱氢表雄酮(DHEA)、睾酮、表睾酮、雄酮和苯胆烷醇酮等5种激素进行检测

        材料与仪器

        步骤

        1.样品收集

        健康志愿者6名,其中男性3名,女性3名。志愿者受试前留取空白尿液; 口服120 mg DHEA片剂后,再收集0~24 h的尿液,于-20℃下保存。

         

        2.样品处理

        取尿液210 mL于试管中,加入5 ng甲基睾酮(内标)及210 mL pH6.8的磷酸缓冲液、150 μL β-葡萄糖醛酸甙酶(3 000 U),于80℃恒温水浴中培养3 h,取出后冷却至室温。再加入3.5 mL乙醚,混旋,离心,取出有机相并于60℃水浴中挥干,残渣中加入100 μL 流动相溶解,供LC-MS/MS分析。

         

        3.色谱及质谱条件

        液相色谱:采用Cosmosil C18色谱柱(150 mm×2 mm,5μm )和Phenom enex C18预保护柱。流动相为甲醇-0.1%甲酸缓冲液(含0.02 mol/L乙酸铵) (体积比为68∶32) , 流速为200 μL/min。进样量为5 μL。

         

        串联质谱:采用电喷雾电离源( ES I) ,在多反应监测(MRM )正离子模式下扫描。碰撞气(CAD )压力为48 263 Pa;气帘气(CUR)压力为68 948 Pa;雾化气(GS1)压力为241 317 Pa;辅助加热气(GS2)压力为275 790 Pa。喷雾电压为5 500 V;离子化温度( TEM )为500 ℃。


        选取各目标物的两组特征母离子 /子离子对 ,分别优选其最佳碰撞电压 (CE)和去簇电压 (D P ) 。并采用丰度较强的一组母离子 /子离子对进行定量分析。

        注意事项

        1. 液相色谱分离条件的优化是本研究的关键。睾酮与表睾酮、雄酮与苯胆烷醇酮均为同分异构体 ,具有相同的母离子和子离子 ,必须依靠色谱方法进行分离。


        2. 每个目标物选取低、中、高 3种浓度的样品 ,以3种浓度样品与对应标准溶液测定结果相比求得回收率 ,并考察方法的精密度、准确度。

        常见问题

        来源:《液相色谱-串联质谱法测定尿液中的内源性类固醇激素》

        来源:丁香实验

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