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        放射免疫对流电泳

        相关实验:放射免疫对流电泳实验

        最新修订时间:

        原理

        将放射性元素标记的抗体(或抗原)与相应的抗原(或抗体)沉淀时,沉淀线通过自显影而证实。所谓自显影,就是通过复合物中的标记同位素在蜕变过程中放出的射线,作用于感光材料的卤化银晶体而产生潜影,再经过显影把像显示出来。这样,能检出肉眼看不见的沉淀线,从而提高反应的敏感性,这种方法可应用于凝胶中的所有反应。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料
         
        1.  放射性同位素标记的抗原或抗体
         
        2.  X-射线胶片或全色胶片
         
        3.  显影液与定影液
         
        4.  其它同对流免疫电泳
         
        二、操作方法
         
        1.  按对流免疫电泳制备凝胶板并打孔。
         
        2.  加样阴极端孔内加抗原,阳极端孔内加抗体。在加被检抗体样品时,迅速加入标记抗原(2 000~3 000 cpm),并使之混合,勿使抗原吸收后再加标记抗原,以免由于标记原的滞面而形成假阳性。
         
        3.  电泳电流2.6 cmx7.5 cm的小板用4 mA。
         
        4.  电泳后,平板浸在3%HCl中漂洗8 h,换液2次。
         
        5.  用流水漂洗过夜。
         
        6.  干燥室温或鼓风机吹干。
         
        7.  曝光在暗室将胶片切成与平板一样大小,然后将药面密接凝胶面,再在胶片上压一张玻板,用黑布包严,皮筋扎紧,曝光时间与所用同位素及保存期有关。181I,一周内5 h~10 h;1~2周内24 h;2~3周内48 h。125I,在2个月内10 h。
         
        8.  冲洗全色胶片冲片方法,水洗、20℃显影10min、水洗、定影、水洗、凉干,观察结果。
         
        三、结果判定
         
        在抗原抗体孔之间形成一条清晰的黑色影像者,判为阳性。

        注意事项

        1. 当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假阳性,它靠近阳极呈弧状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别,即阳性对照孔与待检孔间距为0.2cm,在两孔中间相距0.4cm处打抗血清孔,加样后电泳,两沉淀线吻合为阳性,相交为阴性,其它试验条件与以上试验相同。


        2. 电泳缓冲液的pH值、离子强度、电压和电泳时间对检测结果均有影响,应注意控制。


        3.  电泳时间随孔间距的增大需适当延长。当两孔距离为1cm时,电泳时间为1.5——2h;孔间距为0.6cm时,电泳时间为1h。


        4. 抗原与抗体浓度比例应适当,可通过稀释抗原适当调整,以免出现假阴性。

        常见问题

        1. 结果判定:在抗原抗体孔之间形成一条清晰的黑色影像者,判为阳性。


        2. 该方法简单快捷,敏感度比双相免疫扩散法高8——16倍。


        3. 必须使用高特异性、高亲合力的诊断抗体,否则结果难以解释。


        4. 必须选用有高电渗作用的琼脂作支撑介质。

        来源:丁香实验

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