放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

蛋白质的可逆磷酸化是细胞多种功能调节的基础，在蛋白激酶（protein kinase）和蛋白磷酸酶的双重控制下进行。原核生物的蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）主要参与细菌的趋化性调控，发生磷酸化的残基是组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。在真核生物，磷酸化则主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体 ATP 的易得性，使其成为真核细胞信号应答网络最普遍的调控手段。

早期蛋白磷酸化分析主要采用放射性核素示踪技术，耗时并对环境和操作人员造成危害；抗磷酸化抗体，尤其是针对特定蛋白磷酸化基团的抗体的应用大大简化了磷酸化蛋白的分析流程，质谱技术的发展则为直接分析磷酸化位点提供了新的手段。

放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析的主要方法有 3 种：放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析、放射性核素示踪法蛋白质磷酸化分析－细胞内 32 p 标记实验和特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析。

原理

放射性核素示踪法蛋白质磷酸化分析的基本原理是：只要有适宜的前体物质可以用于标记，放射性核素示踪理论上就可以应用于所有的翻译后修饰分析。利用 32 P 标记的无机磷酸盐（32 Pi）进行生物合成标记可以用于观察细胞的磷酸化状态变化。

来源：丁香实验团队

操作方法

特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析

特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析是放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析的一种方法。如果在细胞裂解后，利用特异性抗体进行免疫沉淀后再行酸水解，放射性自显影的信号则可以确定该种蛋白在哪种氨基酸残基上发生了磷酸化。如果 1 条多肽链中只有 1 个丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸被磷酸化，磷酸化位点的确定比较容易，但是在大多数情况下，蛋白质都存在数个磷酸位点，使得分析比较困难。

免疫复合物的体外激酶活性测定

体外蛋白激酶活性测定（in vitro kinase assay）实际上是在无细胞体系中利用 γ－32 P－ATP 作为磷酸基团供体进行的蛋白质磷酸化分析。