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        RNA 干扰技术

        实验分类:

        RNA 实验

        别名:

        RNAi

        最新修订时间:

        简介

        转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi),与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。

        目前为止较为常用的制备 siRNA的方法有化学合成、体外转录、长片段dsR-NA经RNA酶I类降解(如Dicer,E.coli的RNA酶II)体外制备 siRNA,以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

        前面的3种方法主要都是体外制备siRNA,并且需要专门的RNA转染试剂将 siRNA转到细胞内。

        而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于从转染到细胞的DNA模板中在体内转录得到siRNA。

        这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

        而将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转染至真核细胞中的方法不外乎以下几种:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、机械法[如显微注射和基因枪(biolistic particle)]和阳离子脂质体介导的转染。

        原理

        siRNA 表达框架制备siRNA法的基本原理是: siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SEC)是一种由PCR得到的 siRNA表达模板,包括一个RNA聚合酶I启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA聚合酶II终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中,具体过程如图所示。
         
        阳离子脂质体介导的转染的基本原理为:脂类的头部基团之间的离子相互作用,脂类的头部基团携带很强的正电荷,可中和DNA磷酸基团的负电荷,因而阳离子脂类可以与DNA自动形成可与细胞膜融合的单层外壳,从而将DNA导入细胞内。

        来源:丁香实验团队

        操作方法

        RNA干扰技术

        转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi),与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。目前为止较为常用的制备 siRNA的方法有化学合成、体外转录、长片段dsR-NA经RNA酶I类降解(如Dicer,E.coli的RNA

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