PCR 测序实验

直接测序法的基本原理是 PCR 扩增获得双链 DNA 产物经变性形成单链，测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火。退火的引物在低进行性反应条件下（如低温和低 dNTP 浓度），通过 DNA 聚合酶催化作用延伸 20 ~ 80 个核苷酸；由于此反应体系中掺入放射性标记的 dNTP, 能使新合成的 DNA 链中含有多个放射性标记，便于产生高放射显影度。标记的 DNA 链在高进行性反应条件下，通过 DNA 聚合酶催化进行延伸，通过在反应体系中掺入 ddNTP，使链延伸反应终止。反应产物经过电泳分离和放射自显影，就可以进行序列判读。

循环测序法的基本原理是利用热循环仪高效的自动循环能力，使链终止的序列产物以线性方式获得扩增，从而产生高显影度的序列梯度。首先将 PCR 扩增的 DNA 经变性形成单链形式，使标记引物（³²P、生物素或荧光标记) 与其中的一条链上的互补序列退火。退火后的引物在耐热 DNA 聚合酶催化下发生链延伸-终止反应。由此产生的模板链与延伸终止链形成的部分双链产物在下一轮测序循环中，再次被变性，释放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下每轮循环产生的链终止产物。这种循环步骤重复 20 ~ 40 次，使链终止产物以线性方式扩增。