痘苗病毒系统基因表达实验
DNA 实验
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简介
本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体 T7 RNA 聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶启动子（PT7）的控制下。应用脂质体转染，重组质粒进入感染了 vTF7-3 的细胞质中，而 vTF7-3 是一种能编码噬菌体T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒（见「重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染」）。在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶转录。这种转染方案适用于分析的目的，因为不需要构建新的重组病毒，所以比较简单。
对于大规模的工作，PT7 操纵的基因可以通过同源重组插入另一个重组痘苗病毒中，使之与 vTF7-3 共同感染悬浮细胞（见「两种重组痘苗病毒共感染细胞」）表达的蛋白质可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分析鉴定，用「离子交换层析实验」描述的方法纯化。
内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》
来源：丁香实验
操作方法
1. 用 CsCl/溴化乙锭离心或 PEG 沉淀纯化重组质粒，每孔细胞需要 5 μg DNA 进行转染。如果使用 pTM1 质粒（图 16.16.2）, 必须保证目的基因起始 ATG 位于 pTM1 的 NcoI 位点。可以通过限制酶作图或 DNA 测序鉴定构建是否正确。2. 在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培养基将 5×105 CV-1 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养。直至细胞几乎汇
两种重组痘苗病毒共感染细胞1. 对于贴壁培养的单层细胞：1.1 感染 CV-1 贴壁单层细胞：在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培养基将 5 × 105 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养，直至细胞几乎汇片生长（一般过夜）。1.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶，涡旋混匀，温育 30 min，每隔 5～10 min 晃动一次。MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质
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