细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义。

细胞凋亡途径中各事件的发生是有时序性的，即各事件按先后顺序依次发生，最终导致凋亡小体的出现，细胞随着发生凋亡。

其典型特征如下：
 早期凋亡：细胞膜结构发生改变，磷脂酰丝氨酸外翻；
 早中期凋亡：细胞质密度增加，线粒体膜电位消失细胞膜，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆中；

 中晚期凋亡：细胞凋亡信号转导；

 晚期凋亡：DNA降解为180~200bp片段大小。
 

 

图1：细胞凋亡途径各时序性事件发生及检测方法

 

一、凋亡早期：Annexin-V/PI双染色法（PS在细胞外膜上的检测）

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，细胞发生凋亡时，细胞膜发生变化，PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜即可鉴别凋亡细胞和活细胞。
 

坏死的细胞PS同样也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin-V也能识别坏死细胞表面的PS,所以Annexin-V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，能够与细胞内DNA结合，而且它不能透过完整的细胞膜。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内的PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。
 

 

图2：Annexin-V/PI双染色后流式检测结果分析

 

二、凋亡早期：JC-1染色（线粒体膜电位变化的检测）

在细胞凋亡的过程中往往伴随着线粒体跨膜电位的破坏，这被广泛认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一。它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、JC-1、JC-10等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
 

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针，表现出电势依赖性的积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm，Em=590 nm）；而凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。JC-1的流式检测是比较常见的一种方法。
 

 

图3：JC-1的流式检测实验结果分析

 

三、凋亡晚期：TUNEL法（DNA片段原位标记法）

细胞凋亡晚期，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将荧光素/酶标记的dUTP结合到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
 

 

图4：利用TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)检测3T3-L细胞（小鼠前脂肪细胞）凋亡情况
 

 

图5：利用TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)检测石蜡切片样本
 

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