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- EK-Bioscience
- 国内
- MY8002
- 2025年07月14日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
3年
- 英文名：
pET28a-TagRFP-N
- 库存：
2ug
- 供应商：
酶研生物
- 规格：
2ug
已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤:
细菌培养物的生长。
细菌的收获和裂解
质粒DNA的纯化。
二、质粒DNA的小量制备
细菌的收获和裂解
收获
碱裂解法
煮沸裂解
质粒DNA小量制备的问题与对策
质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法
(一)细菌的收获和裂解
1.收获
1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2.碱裂解法
1)将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面
均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。pET28a-TagRFP-N载体/pET28a-TagRFP-N质粒图谱/pET28a-TagRFP-N序列
3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后
将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
5)可做可不做:加等量酚:氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。
ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。
pET28a-TagRFP-N载体/pET28a-TagRFP-N质粒图谱/pET28a-TagRFP-N序列
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:
(二)质粒DNA小量制备的问题与对策
裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题:
1)有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。
2)在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。
(二)细菌的收获和裂解
1.收获
1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
2)按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。
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文献和实验是许多转录共抑制复合物中的活性成分。HDACl 和 HDAC2 均与介导转录抑制的 mSin3A 有关。通过与许多序列特异性的转录因子相互作用，可使HDAC―mSin3 复合物结合到特异性的启动子，抑制相关基因的表达。这些转录因子包括未结合配体的核激素受体[如维甲酸受体(RAR)及甲状腺受体(TR)]、Mad／Max 及 Mix／Max 异二聚体、MeCP2、p53 等。 2.组蛋白甲基化与去甲基化 组蛋白甲基化是指在组蛋白甲基转移酶催化下组蛋白 H3 和 H4 的 N 端赖氨酸或者精氨酸残基发生的甲基
明显现色，不过那一次的二抗用的比较多，出现了一些非特异的显色。 再往后我做分泌表达，使用的是pet22b载体，pelB信号肽引导分泌，目的基因克隆于NcoI和BamHI之间。诱导表达后检测发现表达量明显上升，可是目标蛋白的分子量却变成了21kd左右，比单独表达带大2kd左右，正好是pelB 22aa的分子量大小，表明信号肽序列没有被切除，周质蛋白分析没有发现目标蛋白，这几乎证明了我的蛋白没有分泌出来。接下来，我作了表达条件的优化，包括iptg，温度（最低到了25度）,时间等，结果仍然没有改善
是由IRES序列行使功能的，但要注意的是，这部分的翻译水平比较低，比前面的MCSA大概低一个数量级。所以要选择好两个蛋白的各自位置。 3)、哺乳动物/真核荧光载体 pEGFP-N1 pEGFPN1 表达 绿色 荧光蛋白和目的基因的融合蛋白，目的基因位于N端 kan/neo 4.7kb E. coli/mammals pEGFP-N3 pEGFPN3 表达 绿色 荧光蛋白和目的基因的融合蛋白，目的基因位于N端 kan/neo 4.7kb E. coli/mammals pEGFP
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