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- 荧光定量PCR实验（realtime PCR）服务
- 山东
- 2025年12月30日
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菲优特
- 服务名称：
荧光定量PCR实验（realtime PCR）服务
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项
定量PCR(Quantitative PCR, qPCR)，也称实时PCR(Real-time PCR)或者实时定量PCR，是指借助荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR指数扩增期间实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度的变化，从而对目的基因进行定量分析的PCR检测技术。
该技术具有特异性强、灵敏度高、污染途径少、检测方法准确等特点，实现了PCR由定性到定量的飞跃，已成为国际公认的核酸定量的标准方法，广泛应用于基因表达丰度、拷贝数等研究及临床疾病检测等许多领域。
荧光定量PCR应用
相对定量PCR
绝对定量PCR
溶解曲线分析
高分率溶解曲线分析
实验步骤
核酸提取(RNA/DNA)-核酸浓度测定-反转录合成cDNA(RNA样品)-荧光定量PCR-实验结果分析
样品类型及样品量：
细胞(≥1×106)；
组织(≥100 mg)；
血液(≥100μl)；
DNA样品(≥2μg，OD260/OD280在1.7-1.9之间，完整性好)；
RNA样品(≥2 μg，OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好) ；
反转录的cDNA (≥2μg，纯度在1.9-2.1之间，完整性好)。
样品保存及运输
对于定量PCR检测：
组织样品液氮速冻后保存于-80℃；
细胞可以直接-80 ℃冰箱保存或加入Trizol后保存于-80℃；
后续样品需用干冰寄送。
注：样品需要注意避免各类污染和反复冻融(以免样品降解)。
我们提供
每个样品上机检测时开展三次平行实验，保证实验结果的准确性；
交付详细的检测报告(包括实验试剂、材料仪器、实验方法、实验结果及分析等)；
可提供RNA或DNA的浓度数据，及qPCR的原始数据(包括熔解曲线和扩增曲线)。
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文献和实验1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15
实时定量PCR也被称为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。 基本原理 在学习实时定量PCR数据处理之前，我们首先需要了解一下它的数学原理，Ct值为什么是我们数据处理过程中的一个关键的因素。这两个图显示的是实时定量PCR的一组结果。上图是原始的线性图谱，下图则是处理过的指数图谱，但是它们两者表示的是同样
的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、 引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点
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