乙酸激酶（ACK)测试盒

乙酸激酶（acetate kinase，ACK）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和 ATP 生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理：

（1）ACK 催化乙酸钠和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，（2）bing酮酸激酶催化 ADP 和 PEP 生成 ATP 和bing酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化bing酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD+，（4）在 340nm下测定 NADH 氧化生成 NAD+速率，即可反映 ACK 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 500μL×1 支，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定

1. 工作液的配置：临用前取试剂二一瓶，加入 10mL 试剂一和 200μL 试剂三，充分混 合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；
2. 在微量石英比色皿或96 孔板中加入20μL 样本和180μL 工作液，混匀，立即记录340nm

处 20s 时的吸光值A1 和 3min20s 后的吸光值A2，计算 ΔA=A1-A2。

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ACK 活性计算：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷( V 样×Cpr) ÷T= 536×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK（nmol/min /g 鲜重）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷( W× V 样÷V  样总) ÷T= 536×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算：