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- 2025年07月14日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
33
- 英文名：
Coenzyme Ⅱ NADP (H) content test kit
- CAS号：
无
- 保质期：
1年
- 供应商：
上海晅科生物科技有限公司
- 保存条件：
2-8℃
- 规格：
100管/48样
辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书
微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用， 使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。所需的仪器和用品
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制
酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1 支，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4 ℃保存一周； 试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周； 试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周； 试剂五：液体 3.6mL×1 支，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。NADP+和 NADPH 的提取
- 血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取
NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
- 组织中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADPH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约
0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；
冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样）：
充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：
混匀，取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间 20min延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。 5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NADP+或 NADPH.
相关图片：
- 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、 加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样）：
| 试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 |
| 样本 | 20 | 20 |
| 试剂一 | 80 | 80 |
| 试剂二 | 30 | 30 |
| 试剂三 | 30 | 30 |
| 试剂四 | 30 | 30 |
| 试剂五 | 30 | 30 |
| 试剂六 | 200 | 混匀，室温避光静置 20min |
| 试剂六 | 200 |
| 试剂七 | 400 | 400 |
注意事项
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间 20min延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。 5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NADP+或 NADPH.
相关图片：
NADP+和 NADPH 含量的计算
（一）NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为 NADP+浓度 nmol/mL1、血清（浆）中NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）
2、组织、细菌或细胞中NADP+含量计算(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr
-
- 按样本鲜重计算
-
- 按细菌或细胞密度计算
（二）NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.6198x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 为△A，x 为NADPH浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× ( △A -0.0259）
2、组织、细菌或细胞中NADPH 含量计算
- 按样本蛋白浓度计算
- 按样本鲜重计算
- 按细菌或细胞密度计算
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆） 体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数， 500 万。
注意：最低检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot
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文献和实验相关实验
与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。三、实验材料、主要仪器和试剂1.实验材料油料作物种子、中速滤纸 2.仪器： （1）索氏脂肪抽提器（图1）或YG-Ⅱ型油分测定器 （2）干燥器（直径15-18cm,盛变色硅胶）（3）不锈钢镊子（长20cm）（4）培养皿（5）分析天平（感量
漏斗冲入100mL 容量瓶中，加水达70-80mL，摇匀后置于80℃恒温水浴上浸提0.5h。 待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入5%硫酸锌5mL，再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2,直至无白色沉淀时，向容量瓶加水至刻度。 3.还原糖含量的测定： 过滤上述已定容的样品液，取5mL 滤液，再定容到100mL（此步视样品的含糖量而定）。取已稀释的溶液2mL，与标准葡萄糖显色法相同：加铜试剂2mL，煮沸10min，加砷钼
1.84); (2)9.2mol/L HClO4; (3)2%蒽酮试剂：同蒽酮法(或9%苯酚，同方法一); (4)淀粉标准液：准确称取100mg纯淀粉，放入100ml容量瓶中，加60～70ml热蒸馏水，放入沸水浴中煮沸0.5h，冷却后加蒸馏水稀释至刻度，则每ml含淀粉1mg，吸取此液5.0ml，加蒸馏水稀释至50ml，即为每ml含淀粉100μg的标准液。 【方法】 1.标准曲线制作 取小试管11支从0～10编号，按表24-3加入
辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒
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