脂溶性Cy5.5

1.产品简介：

   菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，其琥珀酰亚胺 酯是最常用的脂 肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。 通过改变次甲基链的长度，可改 变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照 Huoffman 规则正 好红移约 100nm。 菁染料 Cy3 和 Cy5 已成为基因芯片的首.选荧光标记物；另外,Cy5, Cy5.5 和 Cy7 的吸收在近红外区背 景非常 低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。但 由于菁染 料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。菁染料 特别是水溶性菁 染料分子极性大，分离提纯越加困难。

表 1.菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数



 

	Cy3	Cy3.5	Cy5	Cy5.5	Cy7
脂溶性菁染料SE分子量	568.73	668.84	594.76	694.88	620.80
水溶性菁染料SE分子量	765.95	1234.54	791.99	1260.58	818.01
最大吸收波长(nm)	552	581	650	678	750
摩尔吸光系数(M-'cm-1)	150 000	150 000	250 000	250 000	200 000
最大发射波长(nm)	570	596	670	695	780
A280nm/Amax	8%	24%	5%	18%	11%

2. 操作步骤

2.1 水溶性 Cy3 NHS 标记 anti-GST 多克隆抗体

市场上买到的抗体如果含有其它蛋白(例如 serum albumin 或 gelatin 等)或带氨基的缓冲液会影响标记, 在标记前需纯化。

1.在 1 L 0.15 M NaCI 溶液中透析 anti-GST 抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL),常温透析 4 小时。
2.在 4°C 用新鲜的 1 L 0.15 M NaCI 溶液再透析过夜。
3. 第二天用 1 L 0.1 M NaHCOs (pH 8.3)透析 4 小时。
4. 用 0.22 卩 m 注射器过滤头过滤抗体溶液。
5.用 0.1 M NaHCOs 稀释少量的抗体，在 280nm 处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量(IgG antibody 摩尔 吸光系数 170 000 cm" at 280 nm).
 6.用 DMS。配置 Cy3 NHS (MW 765.95)溶液浓度为 10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的 CyDye NHS 和抗体的比值(例如 20:1),然后慢慢'寿其入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅 拌 45 分钟。
7.用 1 L 0.15 M NaCI 溶液常温避光透析 4 小时除去未标记上的 Cy3。



8.在 4°C 用新鲜的 1 L 0.15 M NaCI 溶液再避光透析过夜。
9.用 1 L of 0.01 M PBS/ 0.01%叠/化钠溶液常温避光透析 4 小时，在 4°C 常温避光再次透析 过夜。
10.用 0.22 卩 m 注射器过滤头过滤抗体溶液。
11.用 0.01 M PBS/0.01 %叠/化钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量 280nm (蛋白)和 552nm (Cy) 处的紫 外可见吸光度。
12,产品冷冻干燥成粉末或在 0.01 M PBS/ 0.01%叠/化钠溶液中，-20°C 避光储存。

2.2 水溶性 Cy5 NHS 标记

1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于 400 pL DMS。后，加入到 1mL 的玻璃瓶中盛有 (D-seQ-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg)的 400 pL DMS。溶液。(Dye 和 peptide 投料比是 1:1)
2. 然后加入 15 卩 L 三乙.胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。
3. 用 HPLC 纯化蛋白，使用蛋白 C18 柱子(25cmx10mm),每次上样注入 2x400 卩 L, 30 分钟 梯度洗脱从 0.1% TFA 水溶液到 MeCN：HQ (0.1% TFA) =70：30,流速 4mL/min°(对不同的 蛋白选择不同的合 适 HPL C 梯度流动相)
4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20°C 避光储存；必要肘可用质谱表征。
6. CyDye 标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的 IgG 在 4 °C 可避光保存 2 月；更长 期的保存需加入等 体积的甘油-20 °C 避光保存。

2.3 水溶性 CyDye SE 标记

         氨基封端的 OLIGO 可以标记 CyDyeSE,但是非常困难；标记前因为 OILGO 经氨.水脱保护， 请务必洗涤掉 所有的残余氨.水。然后将样品真空干燥；然后溶于 0.25 ml 的 0.5 M NaCI 溶液 中，用 Sephadex G-50 脱 盐，用 5.0 mM borate 缓冲液平衡到 pH=8.0,然后用以上硼酸缓冲液 冲下 OLIGO。然后浓缩至干的样品溶于 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在 0.5mL 碳酸 缓冲液中 30 nmoles 的。LIGO 加入到 CyDye SE 的玻璃 瓶中室温避光，密闭搅拌反应 60min。 反应物经 Sephadex G-50 或 RP-HPLC 过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides 和 oligopeptides 由于太小会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，无法标记。

2.4 活体成像领域

SPF 级 BALB/C 裸鼠，6-8 周龄，18-20 克，实验前 24 h 自由进食、饮水。

于实验裸鼠腹腔内注射 2%戊巴/妥钠 300^(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活 体成像系统的记录暗箱中。实验时将 Cy7 或 Cy7 标记的生物分子或药物 DMSO 稀释后，于裸鼠尾静脉注射 200pL( 0.5 mg/g)［最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药 物试剂等条件优化］，每 5min 记录 1 张动物 在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分 布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速 解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾 等脏器，进行成像。





 Cy7 检测时激发波长 700〜770 nm 带通，发射波长 790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描 范围 780〜950 nm，扫描步进 10 nm。曝光时间为 500 ms。

不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐歩向膀胱聚集， 呈现显著的肾 排泄的特点一般 4~6 小时，快得只有 30 分钟；如果是骨骼等部位靶寻的 Cy7 标 记药物，有客户反映一周后 活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于 4%多聚甲醪也不 4 小时以上，0%, 20%, 30%PBS 蔗糖依次 沉底，20 卩 m 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，B 応干，DAP'染色。共聚焦 显微镜观察，激光器为氨氤 633 nm。

稳定性与储存：

未幵封的粉末在避光干燥-20°C 存放 12 月。CyDye NHS 水溶液现配现用不能储存。任何 溶解后的 CyDye NHS 粉末最好立即使用；无水 h；DMSO 瞥/- 20°C 保存最多 2 个星期。

相关产品 Cy 系列：
 

目录号	产品名称	Ex (nm)	Em (nm)	产品描述	规格
C1050	Cy3	548	562		5mg
C1051	Cy3, SE	548	562		1mg
C1053	Cy5	646	664	活体成像用试剂	5mg
C1054	Cy5, SE	646	664	活体成像用试剂	1mg
C1056	Cy5.5	673	692	活体成像用试剂	5mg
C1057	Cy5.5, SE	673	692	活体成像用试剂	1mg
C1058	Cy7	747	774	活体成像用试剂	5mg
C1059	Cy7, SE	747	774	活体成像用试剂	1mg