LabpO TOPO-TA/Blunt通用克隆试剂盒（零背景

LabpO TOPO-TA/Blunt通用克隆试剂盒






产品货号：PT0101
储存温度：－20℃储存，至少12个月。冰袋运输，1-2 天置于室外常温不影响质量。

 

试剂盒组成	20次	80次
TOPO-TA/Blunt Vector(30ng/ul)	40ul	160ul
1000bp Control（30ng/ul）	5ul	5ul
10 Enhancer	20ul	80ul

产品介绍
本制品和传统的T4连接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬间（几秒钟-几min）、高效（接近100%）连接DNA片段的原理采用本公司独创的工艺制成。
（1）可以在瞬间（几秒钟-几min）完成任意PCR产物（兼容A末端/平末端）连接。
（2）特制的新型载体质粒大小仅仅不到2kb，充分发挥了TOPO载体越小，可容纳片段越大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统载体小2kb以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。
（3）采用氨苄抗性载体只需10min复苏时间，比卡那抗性载体1小时复苏时间缩短6倍。
（4）最快可以不用冰浴和热休克，室温5min内完成转化；无需1小时复苏，只需37℃10 min复苏便可以涂板。从连接到涂板最快只需15-20min。
（5）自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需繁琐蓝白斑筛选和菌落PCR筛选。大部分情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近100%）。
（6）连接长片段能力远超传统TA/Blunt克隆载体，可连接长达10kb片段（例如连接5kb片段，也可能达到挑10个菌落，至少8个是有插入的效果），是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的TOPO TA/Blunt克隆载体。
注意：测序只能采用M13F/M13R通用引物测序（见后面图谱），但是不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物测序。菌落 PCR 可使用和测序相同的引物。





操作步骤
1.连接反应的准备：
PCR引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物）。任意PCR产物（兼容A末端/平末端）均可以直接连接。PCR产物一般建议胶回收纯化，这样可以避免后续可能的问题。如果PCR产物仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
2.连接反应：
1）室温（25℃-37℃）设立10ul连接体系（建议用0.2ml PCR 管，PCR仪器控温）：

纯化后的PCR产物或1ul 1000bp control	0.5-5ul
TOPO-TA/Blunt Vector	2ul
10 x Enhancer	1ul
无菌水	Xul
总体积	10ul

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（25℃-37℃）进行。
注：如果使用5ul体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）

插入片段大小（bp）	推荐用量（ng）
100-1000	10-40
1000-2000	40-80
2000-5000	80-180

2）室温（25℃-37℃）连接5min。
本载体推荐室温（25℃-37℃）5min完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到10-15min，温度可选37℃，可显著增加转化子数量。

3）连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或者快速转化步骤。
3.快速转化：
1）感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约1-3min左右）。

2）立刻加入5ul连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)， 用手拨打离心管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰浴放置5min。


3）42℃水浴热激60秒，迅速放回冰浴静置2-3min，该过程不要摇动离心管。
注意：此步骤首xuan建议 42℃水浴 60 秒热激。但是根据我们的经验，大部分商品化的TOP10 和 DH5a 感受态细胞此步骤也可将离心管置于室温（˃22℃）进行， 时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置 5-8min左右；如果室温较低，可延长时间至8-15min左右。有经验的客户可以根据具体情况尝试无热激转化。
4）加 300-500ul LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 200 rpm 振荡培养10min。

根据经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置37℃温箱回温至22℃-37℃）加入到感受态细胞的1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。

一般商品化的感受态细胞不超过 2kb 插入片段情况下，热休克后 10-15 min复苏可以得到足够多转化子，如果使用实验室自制的感受态效率低、或者转化子少、插入片段长的情况下可以提高复苏时间到 30-60 min以得到更多的转化子。

5）取100-200ul菌液涂板(培养板含氨苄青霉素100ug/ml），培养过夜。（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm 离心1min，吸弃掉部分上清，保留100-150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）
4.转化子的筛选鉴定：
本制品采用自杀基因零背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下可以不用菌落PCR 鉴定,直接挑 1-2 个菌去测序。

1)一般本公司TOPO 载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情况下建议省略菌落 PCR/菌液 PCR 鉴定直接去测序。注意测序引物不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物测序。
2) TOPO 载体的菌落 PCR 结果容易出现假阴性。因此在使用菌落 PCR 鉴定的情况下，如菌落 PCR 结果阳性，一般可以相信此结果。如结果是阴性，或者显示扩增出大小和预期不符合，一般不可相信，要考虑到菌落 PCR 结果假阴性的可能。需要进一步提取质粒电泳跑大小，或者酶切鉴定来确认。

用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒，还可用 EcoR I/Ecor V 单酶切释放插入片段或用其它合适的酶切，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。

 pTOPO-TA/Blunt 载体图谱：

 pTOPO-TA/Blunt 载体多克隆位点序列：