Qiagen 47014/47016强力土壤DNA提取试剂盒

DNeasy PowerSoil Pro试剂盒 目录号 制备次数	(50)	(250)
	47014	47016
	50	250
PowerBead Pro Tubes	50	250
MB Spin Columns	50	250
Solution CD1	40 ml	200 ml
Solution CD2	15 ml	60 ml
Solution CD3	35 ml	175 ml
Solution EA	36 ml	175 ml
Solution C5	30 ml	175 ml
Solution C6	9 ml	66 ml
Microcentrifuge Tubes (2 ml)	100	500
Elution Tubes (1.5 ml)	50	250
Collection Tubes (2 ml)	100	500
Quick-Start Protocol	1	1

 

五、简单程序

土壤或粪便样品通过化学和机械均质化进行溶解。将裂解缓冲液添加到含有样品的混合锆珠管中。可以使用带珠管适配器的标准台式涡旋或高性能Powerlyser进行珠粒打浆。然后对粗裂解物进行抑制剂去除以进行净化。纯化后，将纯化的裂解物与等体积的DNA结合溶液混合，并通过二氧化硅旋转滤膜。用两步洗涤方案洗涤膜。然后用10mM Tris洗脱缓冲液洗脱二氧化硅结合的DNA。分离的DNA的相关下游应用包括PCR、NGS和酶消化分析。

 

六、方案：有经验的用户 

（1）开始前的重要注意事项 

▶确保PowerBead Pro试管在离心机中自由旋转，无摩擦。

▶如果CD3溶液已沉淀，则加热至60°C直至沉淀溶解。

▶在室温（15-25°C）下进行所有离心步骤。

 

（2）程序 

1. 短暂旋转PowerBead Pro管，确保磁珠沉降到底部。加入最多250毫克土壤和800µl的CD1溶液。短暂涡旋混合。

2. 将PowerBead Pro管水平固定在1.5-2ml管的涡旋混合器适配器上（货号：13000-V1-24)。以最大速度进行涡旋处理10分钟。

注：如果同时使用涡旋适配器进行超过12次制备，则将涡旋时间延长5-10分钟。

注：有关样品均质化的其他方法，请参见第13-14页的详细方案。

3. 以15,000 x g对PowerBead Pro管进行离心1分钟。

4. 将上清液转移至洁净的2 ml微量离心管（提供）。注意：预期为500-600µl。上清液中可能仍含有少量泥土颗粒。

5. 加入200µl CD2溶液，涡旋振荡5秒。

6. 在15,000 x g下离心1分钟。避开沉淀，将最多700µl的上清液转移至洁净的2ml微量离心管（提供）。

注：预期值为500-600µl。

7. 加入600µl CD3溶液，涡旋振荡5秒。

8. 将650µl裂解液加载至MB离心柱中，以15,000 x g的转速离心1分钟。

9. 丢弃穿流液，重复步骤8以确保所有裂解液都通过MB离心柱。

10. 小心地将MB离心柱放入洁净的2 ml收集管（提供）中。避免任何洗脱液溅到MB离心柱上。

11. 向MB离心柱中加入500µl溶液EA。以15,000 x g离心1分钟。

12. 弃去流穿液，将MB离心柱放回同一2 ml收集管中。

13. 向MB离心柱中加入500µl溶液C5，以15,000 x g离心1分钟。

14. 弃去穿流液，将MB离心柱放入新的2ml收集管（提供）。

15. 以高达16,000 x g的转速离心2分钟。小心地将MB离心柱放入新的1.5 ml洗脱管（提供）中。

16. 将50一100µl的溶液C6加入白色滤膜中心。

17. 在15,000 x g下离心1分钟。弃去MB离心柱。此时DNA已准备好用于下游应用。

注：由于溶液C6不含EDTA，我们建议将DNA冷冻保存（一30至一15°C或一90至一65°C）。如需浓缩DNA，请参阅故障排除指南。

 

七、方案：详细 

（1）开始前的重要注意事项 

▶确保PowerBead Pro试管在离心机中自由旋转，无摩擦。

l  ▶如果CD3溶液已沉淀，则加热至60°C，直至沉淀溶解。

l▶在室温（15-25°C）下进行所有离心步骤。 

 

（2）程序 

1. 短暂旋转PowerBead Pro管，确保磁珠沉降到底部。加入最多250mg土壤和800µlCD1溶液，涡旋混匀。

注意：当样本装入PowerBead Pro管后，下一步需进行均质化和裂解处理。该管内含缓 冲液，其功能包括：

(a)帮助分散土壤颗粒；(b)开始溶解腐殖酸；(c)保护核酸免受降解。通过轻柔涡旋混匀，可使样本成分在缓冲液中充分混合并分散。

2. 使用以下方法之一对样品进行彻底均质化：

2a.将PowerBead Pro管水平固定在涡旋混合器适配器上（适用于1.5-2毫升试管，货号13000-V1-24)。以最大速度涡旋10分钟。

注：如果同时使用涡旋适配器进行12次以上制备，则将涡旋时间延长5-10分钟。

注：使用Vortex Adapter将极大程度地提高均质化，从而获得更高的DNA产量。避免使用胶带，因为胶带会变得松动，导致均质化效率降低、结果不一致和产量降低。

2b.使用PowerLyzer 24匀浆仪。PowerBead Pro试管需正确平衡在PowerLyzer24匀 浆仪的试管架中。我们建议以2000转/分钟的速度匀浆土壤30秒，暂停30秒后，再次以2000转/分钟的速度匀浆30秒。

注：以更高转速（高达4000 rpm)对样品进行均质化处理可能会增加产量，但会导致DNA碎片增多。

2c.使用TissueLyser II。将PowerBead Pro管放入TissueLyser适配器组中使用2×24（货号69982)或2毫升试管架（货号11993)及培养皿适配器套装（货号11990)。将适配器旋紧至仪器，以25 Hz转速摇晃5分钟。调整适配器方向，使原 本靠近机器机身的一侧移至最远离机器的一侧。再次以25 Hz转速摇晃5分钟。

注：涡旋/振荡对于完全均质化和细胞裂解至关重要。通过步骤1的化学试剂与本步骤引入的机械振荡相结合的方式裂解细胞。在含有破碎剂的环境中随机振荡微珠，将导致微珠与微生物细胞碰撞并使细胞破裂。

3. 以15,000 x g对PowerBead Pro管进行离心1分钟。

4. 将上清液转移至洁净的2 ml微量离心管（提供）。注意：预期为500-600µl。上清液中可能仍含有少量泥土颗粒。

5. 加入200µl CD2溶液，涡旋振荡5秒。

注：溶液CD2含有IRT，IRT是一种能够沉淀非DNA有机物和无机物的试剂，包括腐殖质、细胞碎片和蛋白质等，必须去除可能降低DNA纯度并抑制DNA下游应用的污染性有机物和无机物。

6. 在15,000 x g下离心1分钟。避开沉淀，将最多700µl的上清液转移至洁净的2ml微量离心管（提供）。

注：预期值500一600µl。

注：此时的沉淀物包含非DNA有机和无机物质，包括腐殖酸、细胞碎片和蛋白质。为获得最佳的DNA产量和质量，请避免转移任何沉淀物。

7. 加入600µl CD3溶液，涡旋振荡5秒。

注：溶液CD3是一种高浓度盐溶液。由于DNA在高盐浓度下与二氧化硅紧密结合，因此溶液CD3将调节DNA溶液的盐浓度以允许DNA结合，但可能仍存在的少量非DNA有机和无机物则不能与MB离心柱滤膜结合。

8. 将650µl的裂解液加载至MB离心柱上，并以15,000×g的转速进行离心1分钟。

注：在高盐溶液存在时，DNA被选择性结合到MB旋柱中的硅胶膜上。污染物通过滤膜，只留下与膜结合的DNA。

9. 丢弃穿流液，重复步骤8以确保所有裂解液都通过MB离心柱。

10. 小心地将MB离心柱放入洁净的2 ml收集管（提供）中。避免任何洗脱液溅到MB离心柱上。

11. 向MB离心柱中加入500µl EA溶液。以15,000 x g离心1分钟。注：EA溶液是一种洗脱缓冲液，用于清除MB离心柱滤膜上的蛋白质和其他非水性污染物。

12. 弃去流穿液，将MB离心柱放回同一2 ml收集管中。

13. 向MB离心柱中加入500µl溶液C5，以15,000×g离心1分钟。注意：溶液C5是一种乙醇基洗涤液，用于进一步清洗MB离心柱中与硅胶滤膜结合的DNA。该洗涤液可去除残留的盐分、腐殖酸及其他污染物，同时确保DNA仍与硅胶膜保持结合。

14. 弃去穿流液，将MB离心柱放入新的2 ml收集管（提供）。

15. 以高达16,000 x g的转速离心2分钟。小心地将MB离心柱放入新的1.5 ml洗脱管（提供）中。

注：此步骤可去除残留的溶液C5。必须彻底去除所有溶液C5的痕迹，因为其中的乙醇会干扰下游DNA应用，例如PCR、限制性酶切和凝胶电泳。

16. 将50-100µl溶液C6加入白色滤膜中心。

注意：将溶液C6置于白色小膜中央，可确保整个膜层充分湿润。这能更高效、完整地从MB离心柱滤膜中释放DNA。当溶液C6流经硅胶膜时，原本在高盐环境中结合的DNA会被不含盐分的溶液C6（10 mM Tris）选择性释放。

17. 在15,000 x g下离心1分钟。弃去MB离心柱。此时DNA已准备好用于下游应用。

注：由于溶液C6不含EDTA，我们建议将DNA冷冻（-30至-15°C或-90至-65°C）储存。如需浓缩DNA，请参阅故障排除指南。

 

八、故障排除指南

（1）意见和建议 

1.土壤处理 

a) 待处理的土壤量 

QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro试剂盒设计用于处理0.25 g土壤。如需了解 有关使用更大样本量的建议，请联系技术支持部门。

b) 土壤样品含水量高 

从PowerBead Pro管（磁珠）中取出内容物，转移至另一支无菌微量离心管（未提供）。将土壤样本加入PowerBead Pro管后，在室温（15一25°C）下以10,000×g离心30秒。用移液枪头尽可能吸除液体。重新加入磁珠至Powe

rBead Pro管，继续执行步骤2的实验流程。

 

2.脱氧核糖核酸 

a) DNA未扩增，请通过凝胶电泳或分光光度计读数来检查DNA产量。过量的DNA会抑制PCR反应。使用DNeasy PowerSoil Pro DNA试剂盒分离的DNA不应需要稀释模板DNA。但是，仍应尝试稀释。如果在尝试上述步骤后，DNA仍无法扩增，则可能需要进行PCR优化。

b)洗脱DNA为棕色如果在样品中观察到颜色，请联系技术支持以获取建议。 

c)浓缩洗脱DNA：最终洗脱DNA的体积为50-100µl。通过加入5-10µl 3M氯化钠溶液并反复振荡3-5次进行浓缩。随后加入100µl 100%预冷乙醇，再次振荡3-5次混合。将混合液置于-30至-15°C环境中孵育30分钟，随后在室温下以10,000×g离心5分钟。弃去所有液体后，用真空干燥机或自然风干残留乙醇。注意避免沉淀过度干燥，否则可能难以重新悬浮。最后将沉淀的DNA用10mMTris缓冲液（溶液C6)按所需体积重新溶解。

d)DNA从孔中漂浮出来。这通常是因为最终样本中残留了C5溶液。在进行凝胶电泳时，请注意步骤15的操作，避免将液体转移至自旋过滤篮底部。乙醇沉淀（如所述“浓缩洗脱DNA”是去除残留溶液C5的最佳方法。

e)DNA储存用溶液C6（10 mM Tris）洗脱DNA，必须储存于−30至−15℃或−90至−65°C以防止降解。DNA可在TE中洗脱而不损失，但EDTA可能抑制PCR和自动测序等下游反应。DNA也可在无菌的、不含DNA的PCR级水中洗脱（货号17000-10)。

 

3.替代裂解法 

a)细胞难以裂解 

添加CD1溶液后，在进行珠磨步骤之前，于65°C下孵育10分钟。从步骤2开始继续执行方案。

b)降低DNA剪切

加入CD1溶液后，涡旋振荡3-4秒，随后加热至70°C并保持5分钟。重复一次该步骤。此替代方法可减少剪切力，但可能会降低产率。

 

九、储存

溶液CD2应在到达时储存于2~8°C。DNeasy PowerSoil Pro试剂盒的所有其他组分和试剂

可在室温（15~25°C）下储存，直至包装盒标签上打印的有效期。