兔抗KCTD13多克隆抗体技术百科

兔抗KCTD13多克隆抗体技术百科蛋白印记Western blot使用
样品裂解
1. 制备细胞培养物裂解物

将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 培养瓶加入 1 ml；每 5×106 细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 培养瓶加入 0.5 ml）。
用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。
在 4 ℃ 下持续搅拌 30 分钟。
在 4 ℃ 预冷的离心机中以 16,000 × g 的转速离心 20 分钟。
轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。


2. 制备组织裂解物

用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。
将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约 5 mg 的组织，向离心管中快速加入约 300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4 ℃ 下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2 小时。
4 ℃ 下在微型离心机中以 16,000 × g 离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。


样品制备

取出小部分 (50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的 2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
还原和变性：在 100 ℃ 下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸 5 分钟，并进行分装。在 -20 °C 下保存裂解物。注意：分装细胞裂解物 (50 - 100 μL)，避免反复冻融循环。
在 37 ℃ 下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以 16,000 × g 离心 5 分钟。

膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。用甲醇“活化”PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照产品说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。

所得膜可用于抗体染色。
在 Western 印迹膜上完成了一抗二抗结合和后续化学发光检测后，往往还需要检测 Actin 和 Tubulin 等表达相对稳定的内参蛋白质或其他蛋白。我司产品Western 印迹膜抗体清除剂可以使印迹膜上的、与靶蛋白质结合的一抗二抗从膜上脱落，这样同一张膜可以用于不同的检测反应，比重新跑一块 SDS-PAGE 更省时省力，同时数据间可比性更强。
本产品具有下列特点:
1. 简单快速，整个过程只需要 30 分钟左右。
2. 不破坏膜上的蛋白抗原，不导致蛋白信号的减弱。
3. 可以反复使用 2-4 次。

兔抗KCTD13多克隆抗体技术百科保存注意事项。作为蛋白质试剂，条件得当，一般都可以保存几个月到几年。对于大部分抗体而言，分装为小等份在 -20 ℃ 或 -80 ℃ 下冻存是最佳的长期保存条件。此外，在收到抗体后，也可暂时保存至4℃冰箱中，短期保存时间为1-2周。也有一小部分抗体适合长期保存于4℃冰箱。分装前应先离心沉降挂在管壁和管盖上的抗体，分装量取决于您的实验常用量，但建议不能少于10μl，以避免蒸发等带来的干扰。分装后的抗体试剂应尽量避免反复冻融，可短时间（1-2周）保存于4℃冰箱中。

反复冻融可能使抗体变性，导致抗体形成聚集体，从而降低其结合能力。对大部分抗体而言，在-20 ℃下保存就已足够；在-80 ℃下保存并无明显优势。保存抗体要避免使用无霜冰箱，因为冻融循环（用于减少霜的形成）会造成抗体反复冻融而失活。

部分抗体试剂中会加入终浓度40%-50%的甘油使其在-20℃下保持溶液状态，从而降低冻融损伤。此类抗体产品请勿储存于-80℃冰箱中，否则仍会凝固。值得注意的是，抗体在加入甘油后容易被细菌污染，操作时应小心，确保无菌。

部分酶偶联抗体，需要保存在 4 ℃，这些抗体经历冻融不仅会影响抗体的结合能力，还会降低酶活性。
偶联抗体（无论是偶联有荧光染料、酶还是生物素）应尽量保存在深色样品瓶中或用锡箔纸包裹样品瓶。暴露于光下会影响偶联物的活性。荧光偶联物尤其容易发生光致漂白，因此在实验各阶段都应避光。
IgG3 同型抗体的独特之处在于其解冻后容易形成聚集体，因此应始终保存在 4 ℃。
腹水液中可能含有蛋白酶，因此收到后应尽快冻存。