人心脏瓣膜内皮细胞永生化

永生化人心脏瓣膜内皮细胞说明书

一、 产品简介

1 、产品名称：永生化人心脏瓣膜内皮细胞

2 、细胞来源：原代人心脏瓣膜内皮细胞

3 、产品规格：1×106 细胞/T25 方瓶

4 、细胞简介：

虽然原代人心脏瓣膜内皮细胞最更能真实地反映心脏瓣膜内皮细胞在人体内的生理状态，但是一方面原代分离培养人心脏瓣膜内皮细胞周期长及对技术人员经验要求较高及人源瓣膜组织非常珍贵，另一方面此原代细胞不能多次传代，这些不利因素制约了原代人心脏瓣膜内皮细胞在实验室的广泛应用。公司的研究团队拥有多年原代细胞分离培养及细胞永生化服务研究经验，成功建立了永生化人心脏瓣膜内皮细胞。

本公司生产的永生化人心脏瓣膜内皮细胞采用酶解法和SV40T 慢病毒感染制备而来，细胞总量约为 1 ×106/T25 方瓶，不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基信息：

我们推荐使用公司研制的永生化人心脏瓣膜内皮细胞完全培养基作为体外培养永生化人心脏瓣膜内皮细胞的专用培养基。

二、使用方法

1 、您收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出 T25 培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，不要打开瓶口直接将细胞放入37℃ , 5%CO2 细胞培养箱中静置 2-3 小时以稳定恢复细胞状态，然后打开瓶子弃去瓶子中培养液，最后按照后面细胞传代步骤进行细胞传代培养。

2 、细胞传代：

1. 弃去培养上清液，每次用3ml 不含钙、镁离子的 PBS 充分清洗细胞，清洗细胞 3 遍；

2. 加 2ml 消化液（0.25%胰酶含有 0.02%  EDTA）于 T25 培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 5-8 分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分成片脱落，此时才能用手用力左右晃动培养瓶，然后拿细胞到自己胸前方并用手拍打培养瓶使细胞完全脱落分散呈现单细胞状态，迅速拿细胞回操作台加入 5ml 此细胞的完全培养基终止消化；

3. 用滴管轻轻混匀细胞悬液并移入 15ml 离心管中，1000rpm 离心 5 min，弃去上清液，再加入 10ml 完全培养基并用滴管轻轻吹打混匀细胞沉淀；

4. 每 5ml 细胞悬液分装到 1 个新 T25 方瓶中进行培养（共用2 个新 T25 方瓶进行培养，旧瓶子要丢弃，不能重复使用）。

5. 传代铺板 16 小时左右换用新鲜完全培养基继续培养，之后每 48 小时进行换液。

3 、细胞冻存：

1. 细胞生长至覆盖 T25 培养瓶 90%以上面积时，弃去 T25 培养瓶中的培养液，用 PBS 充分清洗细胞 3次；

2. 加 2ml 消化液（0.25%胰酶含有 0.02%  EDTA）于 T25 培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 5-8 分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分成片脱落，此时才能用手用力左右晃动培养瓶，然后拿细胞到自己胸前方并用手拍打培养瓶使细胞完全脱落分散呈现单细胞状态，迅速拿细胞回操作台加入 5ml 此细胞的完全培养基终止消化；

3. 用滴管轻轻混匀细胞悬液并移入 15ml 离心管中，1000rpm 离心5 min，弃去离心上清液；

4. 推荐使用我们精心研制的无血清细胞冻存液，用滴管轻柔地混匀细胞沉淀制成细胞悬液，并放置于冻存管中（每管分装 1ml 体积，每 T25 培养瓶细胞建议冻存 1-2 管细胞）；

5. 直接将分装好的细胞冻存管放入-80℃超低温冰箱中，无需程序降温步骤；

6. 如果需要将冻存细胞放置液氮中长期储存，需先将冻存细胞悬液放入-80℃冰箱 16 小时左右，然后方可将冻存细胞转移至液氮罐中保存。

4、细胞复苏：

1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用 75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞转移至含 5ml 完全培养基无菌离心管中，1000rpm 离心 5min ，然后加入 5ml 完全培养基混匀细胞，将细胞悬液转移至 T25 培养瓶中，放置于37℃ , 5%CO2 细胞培养箱中培养；

3）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养，之后每 48 小时进行换液。