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- YBio/钰博生物
- YB-767740-15
- 中国
- 2025年07月11日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 英文名：
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海钰博生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
50次
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。经验丰富的实验技术人员设计探针，对目标基因有高特异性，实验重复性好，灵敏度更高。它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 根据鸟分枝杆菌类结核亚型保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的鸟分枝杆菌类结核亚型。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。
6. 本只能用于科研，足够 50 次 20μL 体系的荧光定量 PCR。
| 编号 | 成分 | 规格 |
| 试剂一 | 2×Probe qPCR Magic Mix | 500μL（本色盖） |
| 试剂二 | 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL（黄盖） |
| 试剂三 | 鸟分枝杆菌类结核亚型探针法qPCR引物混合液 | 100μL（白盖） |
| 试剂四 | 鸟分枝杆菌类结核亚型qPCR探针 | 50μL（棕色管） |
| 试剂五 | 鸟分枝杆菌类结核亚型qPCR阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) |
50μL（黄盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期12个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品
（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性对照管 | 标准曲线样品管（2-7 管） |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 鸟分枝杆菌类结核亚型qPCR 探针 | 1μL | 1μL | 各 1μL |
| 鸟分枝杆菌类结核亚型探针法qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 个待测 DNA 模板 | 7 μL | 不加 | 不加 |
| 超纯水 | 不加 | 7 μL | 不加 |
| 第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） | 不加 | 不加 | 各7μL（2号样到2号管，3 号样到3号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反应 （40 个循环） |
95℃ | 15 sec |
| 60℃ |
1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号） |
|
| 按仪器预设程序进行熔解曲线分析 | ||
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
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