ApoSight™ Green Caspase 3/7 su

简要概述

ApoSight 绿色半胱天冬酶3/7底物是第一个直接检测活细胞中半胱天冬酶活性的荧光探针。它由三个部分组成，包括a）荧光团，b）半胱天冬酶选择性肽片段（DEVD），以及c）细胞穿透部分。细胞穿透部分将探针带入活细胞。进入活细胞后，半胱天冬酶选择性肽片段被半胱天冬酶裂解以释放荧光团。恢复的荧光强度直接与要检测的胱天蛋白酶3/7的活性有关。与活细胞中现有的半胱天冬酶测定相比，ApoSight Green Caspase 3/7底物更加稳定，方便和准确。 ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物释放出Ex / Em〜490/520 nm的荧光团。如NucView试剂所报道的，它不需要DNA相互作用就能发荧光。如FMK肽探针所报道的，它不抑制胱天蛋白酶活性。尽管胱天蛋白酶的荧光FMK肽抑制剂被广泛用于检测活细胞中的胱天蛋白酶活性，但该技术有一些严重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制剂具有很高的细胞毒性，因为FMK肽与活性胱天蛋白酶共价结合。 b）FMK肽与caspase的不可逆共价结合会抑制caspase活性，导致假阳性凋亡。 C） FMK分析具有极高的背景，并且需要大量洗涤，从而导致极低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不稳定，必须立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板进行实验，并易于适应自动化。

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适用仪器

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流式细胞仪
激发：	488nm激光
发射：	530/30nm滤波片
通道：	FITC通道

荧光显微镜
激发：	FITC滤波片组
发射：	FITC滤波片组
推荐孔板：	黑色透明

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.使用96孔板的密度为5×10⁴至2×10⁵细胞/ 100 µL /孔的待测化合物制备细胞
2.加入等体积的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO₂培养箱中于37°C孵育60分钟
4.用HHBS洗涤细胞1-2次
5.使用带有530/30 nm滤波片（FITC通道）的流式细胞仪或带有FITC滤波片组的荧光显微镜分析细胞

 

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。

ApoSight Green Caspase 3/7底物储备液（200X）
在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分试样，以避免重复的冻融循环。
 
2.工作溶液配置
ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液
在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分试样，以避免重复的冻融循环。

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样品示例及操作

悬浮培养中诱导细胞凋亡的实例

1.用2μg/ mL喜树碱处理Jurkat细胞3小时
2.用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3-4小时
3.用4μg/ mL喜树碱处理HL-60细胞4小时
4.用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。
注意，应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导凋亡的最佳细胞密度。

 

荧光显微镜的样品方案

1.用5×10⁴至2×10⁵个细胞/ 100 µL /孔/ 96孔板的密度制备含待测化合物的细胞。
2.向细胞中加入等体积的Caspase 3/7底物工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板）。
3.在5％CO₂培养箱中于37°C孵育60分钟。
4.用HHBS或您选择的缓冲液洗涤细胞1-2次。
5.使用FITC滤波片组的荧光显微镜成像。

 

流式细胞术的样品方案

1.以1：200的比例将200 X ApoSight Green Caspase 3/7底物原液添加到细胞溶液中，并在5％CO₂培养箱中于37°C孵育细胞60分钟。
注意，用于ApoSight Green Caspase 3/7底物标记的细胞可浓缩至约5 X 10⁶细胞/ mL。适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。
2.使用530/30 nm滤波片（FITC通道），通过流式细胞仪检测荧光强度。
注意，要增加信号/背景比，请以约200 g的速度旋转细胞5分钟，用1 mL洗涤缓冲液（例如HHBS或所选缓冲液）洗涤细胞，然后将细胞重悬至所需的洗涤量。

 

图示

图1.使用ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物检测Jurkat细胞中胱天蛋白酶3/7活性。将Jurkat细胞（200,000个细胞/孔/ 96孔板）用1μM星形孢菌素或DMSO处理4小时。将细胞与Caspase 3/7底物工作溶液在37°C下孵育1小时。使用FITC滤波片组，用荧光显微镜拍摄图像。