转基因构建hsp70-CrylAb基因PCR试剂盒

转基因构建hsp70-CrylAb基因PCR试剂盒产品特点:
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强
样品RNA的抽提：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。
样品cDNA合成:
①反应体系
序号  反应物  剂量 1  逆转录buffer  2μl
2  上游引物  0.2μl
3  下游引物  0.2μl
4 dNTP  0.1μl
5  逆转录酶MMLV  0.5μl
6  DEPC水  5μl
7  RNA模版  2μl
8  总体积  10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

Cytokeratin 5/CK5  细胞角蛋白5抗体     0.1ml
5-HT  5-羟色胺抗体     0.1ml
HRPT2/CDC73/Parafibromin  甲状旁腺功能亢进蛋白2抗体（细胞分裂周期73）     0.2ml
5-HTR1A  5-羟色胺受体1A抗体     0.1ml
THOC2  转录因子THOC2抗体     0.2ml
VEGF  血管内皮生长因子抗体     0.1ml
DNA Ligase IV/LIG4  DNA连接酶4抗体     0.2ml
5-HTR1B  5-羟色胺受体1B抗体     0.1ml
5-HTR2B  5-羟色胺受体2B抗体     0.1ml
5-HTR2A  5-羟色胺受体2A抗体     0.1ml
5-HTT  5-羟色胺转运蛋白抗体     0.1ml
5-HTR3  5-羟色胺受体3抗体     0.1ml
5-HTR4  5-羟色胺受体4抗体     0.1ml
5 lipoxygenase/ALOX5  5-脂氧合酶抗体     0.1ml
Phospho-5-Lipoxygenase(Ser271)  磷酸化5-脂氧合酶抗体     0.1ml
Phospho-5-Lipoxygenase(Ser663)  磷酸化5-脂氧合酶抗体     0.1ml
ALOX12/12 Lipoxygenase  12脂氧合酶抗体     0.1ml
Penicillin G  青霉素G抗体     0.1ml
8-OHdG  8-羟基脱氧鸟苷抗体     0.1ml
RYBP/APAP1/CD337  凋亡相关蛋白1抗体     0.2ml
Nkx2.5/Cardiac-specific homeobox 1  心脏特异性同源盒转录因子NKX2.5抗体     0.2ml
ADORA1  腺苷A1A受体抗体     0.2ml
转基因构建hsp70-CrylAb基因PCR试剂盒AMP deaminase 1  腺苷单磷酸脱氨酶1抗体     0.2ml
A2AR/Adenosine A2a receptor  腺苷A2A受体抗体     0.1ml
AACT-Alpha1/A1ACT  α-1抗胰糜蛋白酶抗体     0.1ml
AAK1  AP2关联激酶1抗体     0.2ml
Cyp2-j3  细胞色素P450Ⅱj3抗体     0.2ml
OST-beta  有机溶质转运蛋白OSTβ抗体     0.2ml
AANAT  芳香胺N-乙酰化转移酶抗体     0.2ml
AT2R2  血管紧张素Ⅱ受体2抗体     0.2ml
Influenza A virus (Duck)  鸭流感病毒抗体     0.2ml
TNF-alpha  肿瘤坏死因子-α抗体     0.1ml
AARS2  丙氨酰tRNA合成酶2抗体     0.2ml
TDRD9/HIG1  缺氧诱导蛋白HIG1抗体     0.2ml
SIRT1/sirtuin 1  沉默调节蛋白1抗体     0.1ml
Spindly/CCDC99  亚砷盐相关蛋白抗体     0.2ml
TBX-5  转录因子Tbx5抗体     0.1ml
AAT/Tryptase  α-1抗胰蛋白酶抗体     0.1ml
AATK  AATK细胞凋亡关联酪氨酸激酶抗体     0.2ml
NMP-22  核基质蛋白22     0.1ml
AATF  拮抗凋亡转录因子抗体     0.2ml
ABCA1/ABC1  腺苷三磷酸结合盒转运体A1抗体     0.1ml
ABCD1/CCL22  嗜酸粒细胞趋化蛋白22抗体     0.1ml
ABCB5  ATP结合蛋白家族5抗体     0.1ml
实验步骤：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。