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甲基化检测BSP
服务介绍:
亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)法是检测基因甲基化的经典方法,其原理为:用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶则不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。最后,将PCR产物克隆至载体后进行测序,测序结果与未经处理的序列比较,分析CpG位点是否发生甲基化,这种方法称为BSP-克隆测序法。此方法精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。一般选取10个克隆子的测序结果进行数据分析。
甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后,基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物,即一对结合处理后的甲基化DNA链(引物对M),另一对结合处理后的非甲基化DNA链(引物对U)。检测MSP扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化;若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化。
该方法优点是:检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1μg的基因组DNA,可用于石蜡包埋样本;快速、简单,省时。
实验流程:
取材- DNA提取-亚硫酸氢盐处理-纯化DNA-PCR扩增-TA克隆-测序-发报告
送样运输要求:
动物组织:100 mg(黄豆大小),最少50 mg(绿豆大小),脂肪组织,结缔组织,纤维化组织适当增加,干冰运输。
细胞:1×10^6个细胞,贴壁细胞舒展,未变圆,干冰运输。
全血:最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管,4度运输。
DNA:体积≥50 uL,浓度≥ 50 ng/ul,干冰运输。
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