转氢酶-1酶活测定试剂盒

QYS-23022	转氢酶-1酶活测定试剂盒	微量法 100管/96样
QYS-23023	转氢酶-1酶活测定试剂盒	紫外分光光度法 50管/48样

测定意义
TH 位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六，催化 NADH+NADP+和
NAD++NADPH 相互转化。催化正向反应称为 TH-1。线粒体 NADH 含量增加时会导致线粒体膜的 H+电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上 ROS 的产生。TH-1 促进NADH 转换为 NADPH，从而提高线粒体的抗氧化能力。
测定原理
NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP+）替代 NADP+， TH-1 催化 APADP+还原生成的 APADPH 在 375nm 有特征光吸收，因此通过测定 375nm 光吸收增加速率，来计算 TH-1 活性。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂二：液体 25mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂三：液体 25mL×2 瓶，4℃保存； 
试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；
试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（此步可选做）。
⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-1 活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 375nm，蒸馏水调零。 
2、 样本测定 
（1）工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 样本和 1000μL 工作液，混匀，立即记录 375nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
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