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手把手教你学会 CRISPR Cas9 基因敲除技术

情况下用大约 20～30 单位的酶大约 3 小时可以酶切完全。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的工作浓度为 50～100ng/μl。连接用水将退火后双链寡核苷酸 (10 μM) 稀释 100 倍备用。连接反应体系：T4 DNA 连接酶 5UEcoRV 5U线性化载体 2 μl稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1 μl10× 连接酶 Buffer 1 μl50% PEG4000 1 μl加水补足 10 μl反应条件： 22℃ 30 min， 37℃ 15

手把手教你利用 CRISPR-Cas9 系统精准敲除靶标基因

反向引物：AAAC-(N)20RC2. 引物磷酸化与退火反应在 PCR 仪中进行。.37 ℃, 30 min95 ℃, 5 minPCR 梯度降温到 25℃ ，速速为每秒降低 0.1℃25 ℃, 5 min4 ℃, 5 min放置在冰上或者保存在负 20℃ 冰箱备用。注意：退火这一步如果 PCR 不是梯度 PCR 仪，37 度磷酸化反应后，加热到 95 度变性后取出到室温，让它慢慢降到室温，以保证退火效果。3. Px458M(或 PX459M) 和 EZ-Guide-XH 载体的 BbsI 酶消化

搞定 CRISPR/Cas9 系统操作

CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，今天我们介绍 CRISPR/Cas9 系统操作。以下操作说明是基于作者冰糖个人实验室操作，仅供参考。 质粒介绍我们使用的是 Feng Zhang 实验室的系统的 pX330 质粒，如下图所示： 酶切系统 37 ℃, 3 hr；Run 1% gel，回收。Elute 到 50 mL H2O。我们利用 BbsI 消化载体形成粘末端，以利于下游 oligo 退火产物的连接；酶切时请充分，且绝对不能加 CIP 处理